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生物化学

Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

Es wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung des bakteriostatischen Diamid Masarimycin vorgestellt, einer niedermolekularen Sonde, die das Wachstum von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae hemmt, indem sie auf den Abbau der Zellwand abzielt. Seine Anwendung als chemische Sonde wird in Synergie-/Antagonismus-Assays und morphologischen Studien mit B. subtilis und S. pneumoniae nachgewiesen.

Abstract

Peptidoglycan (PG) in der Zellwand von Bakterien ist eine einzigartige makromolekulare Struktur, die Form und Schutz vor der Umgebung verleiht. Zentral für das Verständnis des Zellwachstums und der Zellteilung ist das Wissen, wie der PG-Abbau die Biosynthese und den Zellwandaufbau beeinflusst. Kürzlich wurde über die metabolische Markierung von PG durch die Einführung von modifizierten Zuckern oder Aminosäuren berichtet. Während eine chemische Abfrage von Biosyntheseschritten mit niedermolekularen Inhibitoren möglich ist, sind chemisch-biologische Werkzeuge zur Untersuchung des PG-Abbaus durch Autolysine unterentwickelt. Bakterielle Autolysine sind eine breite Klasse von Enzymen, die am eng koordinierten Abbau von PG beteiligt sind. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer niedermolekularen Sonde, Masarimycin, einem Inhibitor von N-Acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, und des Zellwandstoffwechsels in Streptococcus pneumoniae vorgestellt. Die Herstellung des Inhibitors über mikrowellengestützte und klassische organische Synthese ist vorgesehen. Seine Anwendbarkeit als Werkzeug zur Untersuchung der grampositiven Physiologie in biologischen Assays wird vorgestellt.

Introduction

Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien 1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat, das aus β-(1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von MurNAc ist das Stammpeptid gebunden. Der Metabolismus von PG beinhaltet ein eng koordiniertes System von biosynthetischen und abbaubaren Enzymen, um neues Material in die Zellwand einzubauen 7,8. Der Abbau von PG erfolgt durch Enzyme, die zusammen als Autolysine9 bezeichnet und basierend auf der Spezifität der gespaltenen Bindung weiter klassifiziert werden. Autolysine nehmen an vielen zellulären Prozessen teil, einschließlich Zellwachstum, Zellteilung, Motilität, PG-Reifung, Chemotaxis, Proteinsekretion, genetischer Kompetenz, Differenzierung und Pathogenität10,11. Die Entschlüsselung der spezifischen biologischen Funktionen einzelner Autolysine kann entmutigend sein, was zum Teil auf funktionelle Redundanz zurückzuführen ist. Jüngste biophysikalische 8,12,13 und Computerstudien 12 haben jedoch neue Einblicke in ihre Rolle im PG-Stoffwechsel geliefert. Darüber hinaus haben jüngste Berichte weitere Einblicke in die Synthese14 und membranvermittelten 15,16,17 Schritte im PG-Metabolismus gegeben. Ein gründliches Verständnis der Beziehung zwischen abbauenden und synthetischen Signalwegen des PG-Stoffwechsels könnte zu bisher unerschlossenen Antibiotikazielen führen.

Während es signifikante Fortschritte in der Methodik zur Untersuchung der Glykobiologie bei Eukaryoten gegeben hat, ist die bakterielle Glykobiologie und insbesondere der PG-Stoffwechsel nicht mit einer ähnlichen Geschwindigkeit fortgeschritten. Aktuelle chemische Ansätze zur Untersuchung des PG-Stoffwechsels umfassen fluoreszenzmarkierte Antibiotika18, fluoreszierende Sonden 19,20 und metabolische Markierung 21,22,23,24. Diese neuen Ansätze bieten neue Möglichkeiten, den bakteriellen Zellwandstoffwechsel zu hinterfragen. Während einige dieser Strategien in der Lage sind, PG in vivo zu markieren, können sie artspezifisch19 sein oder nur in Stämmen funktionieren, denen ein bestimmtes Autolysin25 fehlt. Viele PG-Markierungsstrategien sind für die Verwendung mit isoliertenZellwänden 26 oder mit in vitro rekonstituierten PG-Biosynthesewegen20,27,28 vorgesehen. Der Einsatz fluoreszierend markierter Antibiotika beschränkt sich derzeit auf biosynthetische Schritte und Transpeptidation18.

Das aktuelle Wissen über bakterielle Autolysine und ihre Rolle im Zellwandstoffwechsel stammt aus genetischen und in vitro biochemischen Analysen 11,29,30,31,32. Während diese Ansätze eine Fülle von Informationen über diese wichtige Klasse von Enzymen geliefert haben, kann die Entschlüsselung ihrer biologischen Rolle eine Herausforderung sein. Zum Beispiel führt die Deletion eines Autolysins aufgrund der funktionellen Redundanz33 in den meisten Fällen nicht dazu, dass das Bakterienwachstum gestoppt wird. Dies ist trotz ihrer impliziten Rolle beim Zellwachstum und der Zellteilung 7,12. Eine weitere Komplikation ist, dass die genetische Deletion von bakteriellen Autolysinen zu Meta-Phänotypen34 führen kann. Meta-Phänotypen entstehen aus dem komplexen Zusammenspiel zwischen dem von der genetischen Deletion betroffenen Signalweg und anderen miteinander verbundenen Wegen. Zum Beispiel kann ein Meta-Phänotyp über einen direkten Effekt wie das Fehlen eines Enzyms oder einen indirekten Effekt wie eine Störung der Regulatoren entstehen.

Derzeit gibt es nur wenige Inhibitoren von Glykosidasenautolysinen wie N-Acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) und N-Acetylmuramidasen, die als chemische Sonden verwendet werden können, um den Abbau von PG zu untersuchen. Um dies zu beheben, wurde das Diamid-Masarimycin (früher als fgkc bezeichnet)identifiziert und 35 als bakteriostatischer Inhibitor des Bacillus subtilis-Wachstums charakterisiert, der auf das GlcNAcase LytG32 abzielt (Abbildung 1). LytG ist ein exo-wirkendes GlcNAcase36, ein Mitglied von Cluster 2 innerhalb der Glykosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Es ist das wichtigste aktive GlcNAcase während des vegetativen Wachstums32. Unseres Wissens ist Masarimycin der erste Inhibitor eines PG-wirkenden GlcNAcase, der das Zellwachstum hemmt. Zusätzliche Studien von Masarimycin mit Streptococcus pneumoniae ergaben, dass Masarimycin wahrscheinlich den Zellwandstoffwechsel in diesem Organismushemmt 37. Hier wird die Herstellung von Masarimycin zur Verwendung als chemisch-biologische Sonde zur Untersuchung der Physiologie in den grampositiven Organismen B. subtilis und S. pneumoniae berichtet. Es werden Beispiele für die morphologische Analyse der Behandlung der inhibitorischen Konzentration unter dem Minimum mit Masarimycin sowie ein Synergie-/Antagonismus-Assay vorgestellt. Synergie- und Antagonismus-Assays mit Antibiotika mit klar definierten Wirkungsweisen können ein nützlicher Weg sein, um Verbindungen zwischen zellulären Prozessen zu erforschen38,39,40.

Protocol

1. Allgemeine Methoden HINWEIS: Alle Compounds wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Führen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) auf einer mit Kieselgel XG F254 vorbeschichteten Aluminiumplatte durch. Erkennen Sie Flecken unter einer UV-Lampe, durch Eintauchen in p-Anisaldehydflecken oder durch Aussetzen von I2-Dampf. Zeichnen Sie alle Kernspinresonanzspektren (NMR) auf einem 400-MHz-Spektro…

Representative Results

Masarimycin ist ein niedermolekularer bakteriostatischer Inhibitor von B. subtilis und S. pneumoniae und hemmt nachweislich das exo-wirkende GlcNAcase LytG in B. subtilis 35,37 und zielt in S. pneumoniae 37 auf die Zellwand ab. Masarimycin kann entweder durch die klassische oder mikrowellengestützte organische Synthese mit Ausbeuten im Bereich von 55% -70% effizient hergestellt werden. Die mikrowellenge…

Discussion

Masarimycin ist ein einzelner mikromolarer bakteriostatischer Inhibitor des Wachstums von B. subtilis 35 und S. pneumoniae37. In B. subtilis wurde gezeigt, dass Masarimycin das GlcNAcase LytG35 hemmt, während das genaue molekulare Ziel in der Zellwand von S. pneumoniae nicht identifiziertwurde 37. Die Synthese von Masarimycin entweder mit dem klassischen organischen Synthese- oder Mikrowellenverfahr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschung wurde von der National Science Foundation unter der Fördernummer 2009522 unterstützt. Die NMR-Analyse von Masarimycin wurde durch den National Science Foundation Major Research Instrumentation Program Award unter der Fördernummer 1919644 unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
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References

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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
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