Para obter um inseto axenic, sua superfície de ovo é esterilizada, e a larva eclodida é posteriormente criada usando folhas axenic. Este método fornece uma maneira eficiente de preparação de insetos machados sem administrar antibióticos ou desenvolver uma dieta artificial, que também pode ser aplicada a outros insetos comedores de folhas.
As entranhas dos insetos são colonizadas por diversas bactérias que podem impactar profundamente os traços fisiológicos do hospedeiro. Introduzir uma cepa bacteriana particular em um inseto axenic é um método poderoso para verificar a função microbiana intestinal e elucidar os mecanismos subjacentes às interações entre micróbios intestinais. Administrar antibióticos ou esterilizar superfícies de óvulos são dois métodos comumente usados para remover bactérias intestinais de insetos. No entanto, além dos potenciais efeitos adversos dos antibióticos em insetos, estudos anteriores indicaram que a alimentação de antibióticos não poderia eliminar bactérias intestinais. Assim, dietas artificiais sem germes são geralmente empregadas para manter insetos axenic, que é um processo tedioso e intensivo em mão-de-obra que não pode se assemelhar totalmente a componentes nutricionais em alimentos naturais. Descrito aqui é um protocolo eficiente e simples para preparar e manter larvas axenic de um besouro de folhas (Plagiodera versicolora). Especificamente, superfícies dos ovos de besouro foram esterilizadas, seguindo as quais folhas de álamo sem germes foram usadas para retrotecanças. O status axenic dos insetos foi confirmado ainda através de ensaios dependentes da cultura e independentes da cultura. Coletivamente, combinando desinfecção de ovos e cultivo livre de germes, um método eficiente e conveniente foi desenvolvido para obter a P. versicolora axenic, fornecendo uma ferramenta facilmente transferível para outros insetos comedores de folhas.
Semelhante aos mamíferos, o trato digestivo de insetos é uma cavidade para digestão e absorção de alimentos. A maioria dos insetos abriga diversas bactérias commensais que prosperam em suas entranhas e vivem de nutrição fornecida pelos hospedeiros1. A comunidade commensal intestinal tem um impacto profundo em múltiplos processos fisiológicos em insetos, incluindo digestão e desintoxicaçãode alimentos 2,3,4, nutrição e desenvolvimento 5,6,7, defesa contra patógenos e parasitas 8,9,10,11, comunicação química 12,13 e comportamentos14 15. Curiosamente, algumas microbiota intestinal podem ser facultativamente patogênicas ou manipuladas por patógenos invasores para agravar a infecção, indicando que bactérias intestinais podem ser prejudiciais em alguns casos 16,17,18. As bactérias intestinais também podem servir como um recurso microbiano para aplicações biotécnicas e manejo de pragas. Por exemplo, bactérias digeridoras de lignocelulose de insetos fitofagosos e xilofagos foram usadas para digerir células vegetais para o desenvolvimento de biocombustíveis19. A dispersão de simbionts intestinais projetados expressando moléculas bioativas é uma tática nova e promissora para gerenciar a agricultura e pragas florestais e mosquitos que transmitem doenças infecciosas 19,20,21, que também podem ser usadas para melhorar a aptidão de insetos benéficos 22. Ilustrar como uma bactéria intestinal se comporta in vivo é, portanto, considerada uma prioridade para alavancar plenamente sua função e explorá-la ainda mais para várias aplicações.
Os animais podem abrigar de 1 a >1000 espécies microbianas simbióticas no intestino1. Como resultado, é difícil verificar com precisão como a taxa bacteriana individual ou sua montagem se comportam dentro de um animal, e se o hospedeiro ou seus parceiros microbianos conduzem uma função específica. Portanto, o preparo de larvas machadonicas para obter insetos gnóbitos por colonização mono ou multiespécies é necessário para investigar a função bacteriana e a interação com insetos23. Atualmente, administrar coquetéis antibióticos e esterilizar a superfície dos ovos de insetos são métodos comuns para remover bactérias intestinais 14,24,25,26. No entanto, as dietas antibióticas não podem eliminar completamente as bactérias intestinais e têm um efeito negativo na fisiologiado inseto hospedeiro 27,28. Consequentemente, o uso de insetos tratados com antibióticos pode obscurecer as verdadeiras habilidades de algumas bactérias intestinais. Felizmente, a esterilização superficial de ovos pode negar esse problema23,29, que não tem efeitos ou insignificantes sobre insetos experimentais. Além disso, dietas artificiais não podem se assemelhar totalmente a alimentos naturais para insetos, e desenvolver uma dieta artificial é um processo caro e que consome mão-de-obra30,31.
O besouro-folha de salgueiro, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), é uma praga comedora de folhas generalizada que se alimenta principalmente de árvores salicacesas, como salgueiros (Salix) e álamo (Populus L.) 32,33. Aqui, o besouro-folha de salgueiro foi usado como um inseto representativo que come folhas para desenvolver um protocolo para preparar e criar um inseto livre de germes. Exploramos a cultura do tecido vegetal para obter folhas de álamo sem germes para criar larvas machados P. versicolora de ovos esterilizados. O status axenic das larvas de P. versicolora foi verificado através de ensaios dependentes da cultura e independentes da cultura. Este protocolo pode manter insetos axenic que melhor imitam a condição selvagem do que a criação de insetos com uma dieta artificial. Mais importante, este método é conveniente a um custo muito baixo, o que aumenta a viabilidade de obter insetos axenic para futuros estudos de interação inseto-intestino, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas.
A preparação de larvas livres de germes e a obtenção de larvas gnotobióticas, reintroduzindo cepas bacterianas específicas, são métodos poderosos para elucidar os mecanismos subjacentes às interações hospedeiro-micróbio. Larvas recém-eclodidas obtêm microbiota intestinal de duas formas principais: transmissão vertical da mãe para a prole ou aquisição horizontal de irmãos e ambiente34. O primeiro pode ser cumprido pela transferência dos pais para a prole através da contaminaç?…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation of China (31971663) e pelo Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2020QNRC001).
0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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75% ethanol | Xingheda trade | ||
α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
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Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
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NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
Plastic box | 2.35 L | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
Vortexer | Scilogex | MX-S | |
Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |