체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석
Summary
이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.
Abstract
히스톤 단백질은 DNA와 결합하여 진핵 염색질을 형성합니다. 염색질의 기본 단위는 DNA로 둘러싸인 핵심 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 두 사본으로 구성된 히스톤 옥타머로 구성된 뉴 클레오 솜입니다. 옥타머는 H2A/H2B 이량체의 두 사본과 H3/H4 사량체의 단일 사본으로 구성됩니다. 고도로 충전 된 코어 히스톤은 세포질 및 핵의 여러 단백질과 비특이적 상호 작용을하는 경향이 있습니다. 히스톤 샤페론은 다양한 종류의 단백질을 형성하여 히스톤을 세포질에서 핵으로 셔틀하고 DNA로의 침착을 도와 뉴 클레오 솜 조립 과정을 돕습니다. 일부 히스톤 샤페론은 H2A/H2B 또는 H3/H4에 특이적이며 일부는 둘 다에 대한 샤페론으로 기능합니다. 이 프로토콜은 풀다운 분석, 분석 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리 및 히스톤 샤프롱 분석과 같은 시험관 내 실험실 기술을 함께 사용하여 주어진 단백질이 히스톤 샤페론으로 기능하는지 여부를 확인하는 방법을 설명합니다.
Introduction
DNA와 히스톤 단백질로 구성된 뉴 클레오 솜은 염색질의 구조 단위를 형성하고 몇 가지 중요한 세포 사건을 조절합니다. 뉴클레오솜은 복제, 전사 및 번역 1,2와 같은 다양한 프로세스에 DNA에 접근할 수 있도록 동적으로 재배치되고 리모델링됩니다. 매우 염기성인 히스톤은 세포 환경에서 산성 단백질과 상호 작용하거나 응집되는 경향이 있어 다양한세포 결함을 유발합니다3,4,5. 히스톤 샤페론이라고 하는 전용 단백질 그룹은 세포질에서 핵으로의 히스톤 수송을 돕고 비정상적인 히스톤-DNA응집 사건을 방지합니다6,7. 근본적으로, 대부분의 히스톤 샤페론은 생리적 이온 강도로 히스톤을 저장하고 DNA에 전달하여 뉴 클레오 솜 8,9의 형성을 돕습니다. 일부 히스톤 샤페론은 히스톤 올리고머 H2A/H2B 또는 H3/H410에 대해 확실한 선호도를 갖는다.
히스톤 샤페론은 DNA 합성11에 의존적이거나 독립적 인 뉴 클레오 솜을 조립하는 능력에 따라 특징 지어집니다. 예를 들어, 염색질 조립 인자 -1 (CAF-1)은 의존적 인 반면 히스톤 조절자 A (HIRA)는 DNA 합성12,13과 독립적입니다. 유사하게, 히스톤 샤페론의 뉴 클레오 플라스 민 패밀리는 정자 염색질 축합 및 뉴 클레오 솜 어셈블리14에 관여합니다. 뉴 클레오 솜 어셈블리 단백질 (NAP) 패밀리 구성원은 시험관 내에서 뉴 클레오 솜 유사 구조의 형성을 촉진하고 세포질과 핵15 사이의 히스톤 왕복에 관여합니다. 뉴클레오플라스민과 NAP 계열 단백질은 모두 기능성 히스톤 샤페론이지만 구조적 특징을 공유하지 않습니다. 본질적으로, 단백질을 히스톤 샤페론(16)으로 분류할 수 있는 단일 구조적 특징은 없다. 구조 연구와 함께 기능적 및 생물 물리학 적 분석의 사용은 히스톤 샤페론을 특성화하는 데 가장 효과적입니다.
이 연구는 단백질을 뉴 클레오 솜 조립을 돕는 히스톤 샤페론으로 특성화하는 생화학 적 및 생물 물리학 적 방법을 설명합니다. 먼저, 히스톤 샤페론의 올리고머 상태 및 안정성을 분석하기 위해 분석 크기 배제 크로마토 그래피를 수행하였다. 다음으로, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용의 원동력과 경쟁적 특성을 결정하기 위해 풀다운 분석을 수행하였다. 그러나 이러한 상호 작용의 유체역학적 파라미터는 단백질의 모양과 컬럼을 통한 이동에 영향을 미치는 복합체 때문에 분석 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정확하게 계산할 수 없었습니다. 따라서 정확한 분자량, 상호 작용의 화학량론 및 생물학적 분자의 모양을 포함하는 용액 내 거대분자 특성을 제공하는 분석적 초원심분리가 사용되었습니다. 과거 연구는 yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120과 같은 히스톤 샤페론을 기능적으로 특성화하기 위해 시험관 내 히스톤 샤페론 분석을 광범위하게 사용했습니다. 히스톤 샤페론 분석은 또한 단백질을 히스톤 샤페론으로 기능적으로 특성화하기 위해 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작업은 추정되는 히스톤 샤페론의 생화학적 및 생물물리학적 특성화를 위한 포괄적인 프로토콜 세트를 보여주고 검증합니다. 본원에서, 재조합 발현 및 정제된 NAP 패밀리 단백질, AtNRP1 및 AtNRP2, 및 AtFKBP53의 N-말단 뉴클레오플라스민 도메인을 사용하여 프로토콜을 입증하였다. 동일한 실험 세트가 이전에 특성화되지 않은 히스톤 샤페론의 기능적 특성을 모든 유기체에서 설명하는 데 매우 잘 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
인도 정부 과학 및 공학 연구 위원회[CRG/2018/000695/PS]와 인도 정부 과학기술부 생명공학부[BT/INF/22/SP33046/2019]의 Dileep Vasudevan에 대한 교외 보조금과 부바네스와르 생명 과학 연구소의 교내 지원은 크게 인정받고 있습니다. 히스톤 준비에 도움을 주신 Sudeshna Sen 씨와 Annapurna Sahoo 씨에게 감사드립니다. 동료 Chinmayee Mohapatra 박사, Manas Kumar Jagdev 및 Shaikh Nausad Hossain 박사와의 토론도 인정됩니다.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
