Visualización de cambios en el circuito Neuron-Glia con la técnica de imágenes de calcio
Summary
La imagen de calcio celular es una metodología versátil para estudiar la señalización dinámica de células individuales, en poblaciones mixtas en cultivo o incluso en animales despiertos, basada en la expresión de canales / receptores permeables al calcio que dan firmas funcionales únicas.
Abstract
Aquí, informamos sobre modelos selectivos in vitro de circuitos basados en glía (astrocitos, oligodendrocitos y microglía) y / o neuronas de tejidos periféricos (ganglios de la raíz dorsal) y centrales (corteza, zona subventricular, organoide) que se estudian dinámicamente en términos de cambios de calcio. El modelo elegido para ilustrar los resultados es la retina, un tejido simple con interacciones celulares complejas. El calcio es un mensajero universal involucrado en la mayoría de las funciones celulares importantes. Explicamos en un protocolo paso a paso cómo se pueden preparar y evaluar las células neuron-gliales de la retina en cultivo, imaginando cambios de calcio. En este modelo, diferenciamos las neuronas de la glía en función de su respuesta selectiva a KCl y ATP. Los receptores y canales permeables al calcio se expresan selectivamente en diferentes compartimentos. Para analizar las respuestas al calcio, utilizamos matrices fluorescentes ratiométricas como Fura-2. Esta sonda cuantifica la concentración libre de Ca2+ en base a formas libres de Ca2+ y Unidas a Ca2+, presentando dos picos diferentes, basados en la intensidad de fluorescencia percibida en dos longitudes de onda.
Introduction
Debido a las propiedades universales del calcio como segundo mensajero, este ion está involucrado en un gran número de actividades de señalización: transcripción de genes, nacimiento y muerte, proliferación, migración y diferenciación, transmisión sináptica y plasticidad. Por lo tanto, un método capaz de rastrear la dinámica de activación del calcio con fidelidad y agilidad proporcionaría una forma de observar respuestas espacio-temporales únicas. Tal método es la técnica de imágenes de calcio celular, que correlaciona los datos funcionales de los cambios de calcio con fenotipos celulares específicos en función de sus distintas respuestas.
Las sondas de Ca2+ se desarrollaron por primera vez en la década de 1980, con mejoras posteriores que permitieron que estas moléculas se utilizaran en ensayos de células vivas1. Como indicador químico, Fura-2 se considera el estándar para las mediciones cuantitativas de [Ca2+]i. El éster de acetoximetil (AM) de este indicador (es decir, Fura-2 AM) impregna fácilmente la membrana celular y puede alcanzar concentraciones intracelulares 20 veces mayores que la dilución de incubación (por ejemplo, [5 μM]o/[100 μM]i). Otra ventaja de Fura-2 es que tiene una buena resistencia al fotoblanqueo; por lo tanto, la obtención de imágenes de este indicador durante períodos de tiempo más largos no afectará en gran medida sus capacidades de fluorescencia. Finalmente, Fura-2 es sensible a una amplia gama de niveles de calcio, desde ~100 nM hasta ~100 μM, y tiene un Kd de ~145 nM, que es comparable al resto [Ca2+]i2. Más tarde, las imágenes de calcio celular se desarrollaron con mejores microscopios fluorescentes y métodos de computación, junto con sondas ratiométricas que no se ven afectadas por la carga de colorante.
Cada célula expresa diferentes dispositivos de calcio (bombas, transportadores, receptores y canales) que contribuyen a la respuesta final como una firma particular. El consejo importante es encontrar respuestas selectivas de diferentes tipos de células correlacionadas con su expresión fenotípica. En consecuencia, hay al menos dos receptores diferentes que operan a través de cambios de calcio: receptores ionotrópicos que impregnan Ca2 + en un modo rápido y receptores metabotrópicos lentos acoplados a vías de señalización y existencias intracelulares que liberan Ca2 + activado por segundos mensajeros, como el trifosfato de inositol y el ADP-ribosa cíclico3.
Por ejemplo, las células progenitoras expresan nestina en la retina inmadura y muestran receptores GABAA despolarizados por GABA (o muscimol)4. Esto sucede debido al gradiente electroquímico de Cl– con altos niveles intracelulares de Cl−; a medida que el tejido se desarrolla, los transportadores de KCC2 cambian de excitación en progenitores a inhibición en neuronas GABAérgicas maduras5. Por otro lado, las células madre que expresan sox-2 en la zona subventricular inmadura (SVZ) de roedores postnatales también presentan receptores metabotrópicos H1 activados por histamina aumentando El Ca2+ de forma lenta6. Un segundo receptor metabotrópico de la familia de receptores-1 activados por proteasa (PAR-1), activado por trombina y aguas abajo a G(q/11) y fosfolipasa C (PLC), produce cambios lentos de Ca2+ en oligodendrocitos (que expresan O4 y PLP) generados a partir de células madre neurales SVZ multipotentes7.
En general, las neuronas expresan canales de calcio dependientes del voltaje, así como los principales receptores de neurotransmisores permeables a Ca2+, como los receptores glutamatérgicos (AMPA, NMDA, kainato) y nicotínicos periféricos y centrales. El cloruro de potasio se suele utilizar como agente despolarizante para activar neuronas periféricas, como las neuronas ganglionares de la raíz dorsal8 o neuronas centrales, a partir de la zona subventricular9 o retina10. Por otro lado, el ATP es reconocido como el principal gliotransmisor (además de la D-serina), que activa los miembros P2X permeables selectivos de Ca2+, como P2X7 y P2X4. Ambos receptores presentan corrientes de Ca2+ equivalentes, similares a las mostradas por los receptores NMDA reconocidos como las mayores corrientes de Ca2+ activadas por los transmisores11. Los receptores P2X7 están altamente expresados en microglía, pero a menor densidad en astrocitos y oligodendrocitos, teniendo un papel en la liberación de citoquinas proinflamatorias12. Los receptores P2X7 también se expresan en las células de Schwann13 y en la glía de Müller en la retina14,15.
Se sabe que la retina muestra casi todos los transmisores que se ven en el cerebro. Por ejemplo, el eje vertical (fotorreceptores, células ganglionares bipolares y retinianas) es principalmente glutamatérgico, con receptores AMPA o kainato permeables al calcio expresados en células OFF-bipolares y mgluR6 expresados en células ON-bipolares16. Curiosamente, los tres receptores también se encuentran en la glía de Müller, que están acoplados a las vías de calcio e inositol trifosfato17,18. El eje inhibitorio horizontal, hecho por células horizontales y amacrinas, secreta no sólo GABA, sino también dopamina, acetilcolina, y otros neurotransmisores clásicos. Las células amacrinas son los principales tipos de células que se encuentran en los cultivos de retina aviar, mostrando varios tipos de canales operados por calcio, como canales de calcio glutamatérgicos, purinérgicos, nicotínicos y dependientes del voltaje. Por esta razón, este es un excelente modelo para evaluar diferentes propiedades de los cambios de calcio entre las neuronas y la glía.
Por lo tanto, la combinación de diferentes receptores y canales sumados a marcadores fenotípicos selectivos durante el desarrollo con distintos patrones de respuesta agonista permite firmas únicas en el tallo, progenitor, neurona, astrocito, oligodendrocitos y microglia que operan a través de dispositivos de señalización selectiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos utilizado el tejido de la retina para demostrar que las respuestas de calcio mediadas por KCl o ATP están claramente compartimentadas en respuestas neuronales y gliales, respectivamente (Figura 1). Aunque algunos datos de la literatura implican que los receptores P2X7 se expresan en las neuronas, que regulan la actividad neuronal y la liberación de neurotransmisores sinápticos20, otros autores cuestionan la existencia de receptores neuronales P2X7. De hecho, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Subvenciones, patrocinadores y fuentes de financiación: MH es beneficiario de una beca de doctorado CNPq. HRF es beneficiario de una beca postdoctoral apoyada por CNPq (número de subvención de HRF 152071/2020-2). RAMR cuenta con el apoyo de CNPq y FAPERJ (números de subvención E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 y 312157/2016-9 e INCT-INNT (Instituto Nacional de Neurociencia Traslacional).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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