Summary

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Published: August 29, 2022
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Summary

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Abstract

As células-tronco mesenquimais (MSCs)- especialmente aquelas isoladas do tecido adiposo (Ad-MSCs)-ganharam atenção especial como uma fonte renovável e abundante de células-tronco que não representam nenhuma preocupação ética. No entanto, os métodos atuais para isolar os Ad-MSCs não são padronizados e empregam protocolos complicados que requerem equipamentos especiais. Isolamos os Ad-MSCs da gordura epidídimamal dos ratos de Sprague-Dawley usando um método simples e reprodutível. Os Ad-MSCs isolados geralmente aparecem dentro de 3 dias após o isolamento, já que as células aderentes apresentam morfologia fibroblástica. Essas células atingem 80% de confluência em 1 semana de isolamento. Posteriormente, na passagem 3-5 (P3-5), foi realizada uma caracterização completa para os Ad-MSCs isolados por imunofenofoteping para aglomerados característicos de marcadores de superfície msc de diferenciação (CD), como CD90, CD73 e CD105, bem como induzir diferenciação dessas células pelas linhagenias osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. Isso, por sua vez, implica a multipotência das células isoladas. Além disso, induzimos a diferenciação dos Ad-MSCs isolados em relação à linhagem de células produtoras de insulina (IPCs) através de um protocolo simples e relativamente curto, incorporando o meio eagle modificado de alta glicose Dulbecco (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4. A diferenciação dos IPCs foi geneticamente avaliada, em primeiro lugar, através da medição dos níveis de expressão de marcadores específicos de células β, como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, bem como a coloração de dithizone para os IPCs gerados. Em segundo lugar, a avaliação também foi realizada funcionalmente por um ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em conclusão, os Ad-MSCs podem ser facilmente isolados, exibindo todos os critérios de caracterização do MSC, e eles podem de fato fornecer uma fonte abundante e renovável de IPCs no laboratório para pesquisa de diabetes.

Introduction

As células-tronco mesenquimais (MSCs), também conhecidas como células estromais mesenquimais, estão entre os tipos de células mais amplamente utilizados para a medicina regenerativa 1,2. São classificadas como células-tronco adultas e caracterizadas pelo potencial de diferenciação multilineagem e capacidade de auto-renovação3. Os MSCs podem ser isolados e obtidos de várias fontes, incluindo tecido adiposo, medula óssea, sangue periférico, tecido do cordão umbilical e sangue, folículos capilares e dentes 4,5.

O isolamento das células-tronco do tecido adiposo é visto como atraente e promissor devido ao seu fácil acesso, rápida expansão in vitro e alto rendimento6. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser isoladas de diferentes espécies, como humanos, bovinos, ratos, ratos e, mais recentemente, cabras7. Foi comprovado que os Ad-MSCs são agora potenciais candidatos à engenharia de tecidos e terapia gene/célula que podem até ser usados para desenvolver uma alternativa autóloga para a reparação a longo prazo de lesões de tecido mole ou defeitos 7,8.

A Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT) definiu três critérios mínimos que devem ser apresentados pelos MSCs para caracterização completa9. Primeiro, eles devem ser adeptos de plástico. Em segundo lugar, os MSCs devem expressar marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais como CD73, CD90 e CD105 e falta de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, os MSCs devem exibir a capacidade de diferenciar-se nas três linhagens mesenquimais: adipócitos, osteocitos e condrócitos. Curiosamente, os MSCs também podem se diferenciar em outras linhagens, como células neuronais, cardiomiócitos, hepatócitos e células epiteliais10,11.

De fato, os MSCs possuem propriedades únicas que lhes permitem ser aplicados como potenciais agentes terapêuticos na terapia regenerativa para diferentes doenças. Os MSCs podem segregar fatores solúveis para induzir um ambiente imunomodulatório que proporciona benefícios terapêuticos12. Além disso, os MSCs podem migrar para locais de lesões e microambientes tumorais para fornecer terapia direcionada; no entanto, os mecanismos não são totalmente elucidados13. Além disso, os MSCs têm a capacidade de segregar exosósmos, vesículas extracelulares na nanoescala que carregam uma carga de RNAs não codificantes, proteínas e fatores solúveis, que recentemente surgiram como um novo mecanismo do potencial terapêutico dos MSCs em várias doenças14.

Mais importante, os MSCs têm gerado atenção marcante para seu potencial de diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs), seja por modificação genética15,16 ou através da utilização de vários fatores indutores extrínsecos dentro da mídia cultural in vitro17. O período de indução do IPC varia muito, pois depende do protocolo de indução utilizado e dos fatores extrínsecos utilizados. O processo de diferenciação pode durar de dias a meses, e requer uma combinação de fatores indutores exógenos que devem ser adicionados e/ou retirados em diferentes estágios. Muitos desses fatores que têm sido utilizados para a diferenciação pancreática endócrina são compostos biologicamente ativos que têm sido mostrados para promover a proliferação ou diferenciação/neogênese de células β e/ou aumentar o teor de insulina dos IPCs 18,19,20,21. Vale ressaltar aqui que os MSCs também têm tido efeitos terapêuticos no diabetes e suas complicações através de diversos mecanismos, incluindo seu secretome, bem como uma ampla gama de ações imuno-modulatórias 22,23,24.

Neste protocolo, apresentamos um protocolo passo detalhado para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epidídica de ratos, seguido por um protocolo simples e relativamente curto para a geração de IPCs a partir de Ad-MSCs.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito. O protocolo de isolamento Ad-MSC foi adotado por Lopez e Spencer, com modificações15. 1. Isolamento de Ad-MSCs de almofadas de gordura epidídica de ratos Use ratos sprague-dawley machos pesando 250-300 g que não têm mai…

Representative Results

Isolamento e caracterização de Ad-MSCsComo mostrado na Figura 2, as células isoladas do tecido adiposo mostraram uma população heterogênea de células arredondadas e semelhantes a fibroblastos a partir do dia seguinte de isolamento (Figura 2A). 4 dias após o isolamento, as células do fibroblasto começaram a aumentar em número e tamanho e crescer como uma população homogênea pela passagem 1 (Figura 2B,C</stro…

Discussion

Neste protocolo, conseguimos apresentar um protocolo detalhado para o isolamento dos Ad-MSCs da gordura epidídica de ratos e a diferenciação desses Ad-MSCs em IPCs. De fato, a gordura epidídimal de rato é uma fonte facilmente atingível de tecido adiposo para a obtenção de Ad-MSCs e não requer nenhum equipamento especial, nem para coleta nem para processamentode 15,26,27. Os Ad-MSCs isolados apresentaram excelente expans…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos a Dra. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Em Veterinária, Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica do Egito (BUE) por ajudar na dissecação dos ratos.

Também gostaríamos de reconhecer e apreciar os esforços da Faculdade de Comunicação de Massa, a Universidade Britânica no Egito (BUE) para a produção e edição do vídeo deste manuscrito.

Gostaríamos de agradecer à Srta. Fatma Masoud, MSc, Professora Assistente de Inglês, Universidade Britânica no Egito (BUE) pela revisão e revisão da língua inglesa do manuscrito.

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito.

Materials

Albumin, bovine serum Fraction V MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, USA A3157
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, USA A5533
Ammonium hydroxide Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC Stem Cell Technologies 60024FI
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3912
Calcium Chloride Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA PA5-85917
Chloroform Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder Gibco, Thermo Fisher, USA 17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure Fisher Scientific, Germany G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific, Germany BP231-100
Dithizone staining Sigma-Aldrich, USA D5130
DMEM – High Glucose 4.5 g/L Lonza, Switzerland 12-604F
DMEM – Low Glucose 1 g/L Lonza, Switzerland 12-707F
DMEM/F12 medium Lonza, Switzerland BE12-719F
DNAse/RNAse free water Gibco Thermo Fisher, USA 10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade Sigma-Aldrich, Germany 24103
Exendin-4 Sigma-Aldrich, Germany E7144
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Thermo Fisher, Brazil 10270-106
Formaldehyde 37% Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade Fisher Scientific, USA BP2618500
L-Glutamine Gibco Thermo Fisher, USA 25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USA SC006
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Germany N0636
Oil Red Stain Sigma-Aldrich, USA O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Gibco Thermo Fisher, USA 15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg Lonza, Switzerland BE17-516F
Potassium Chloride Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit Cloud-Clone Corp., USA CEA682Ra
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima Thermo Scientific, USA K0221
Syringe filter, 0.2 micron Corning, USA 431224
TRIzol Thermo Scientific, USA 15596026
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA 15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X Lonza, Switzerland CC-5012
Verso cDNA synthesis kit Thermo Scientific, USA AB-1453/A
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Germany M3148

References

  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

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Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells. J. Vis. Exp. (186), e63348, doi:10.3791/63348 (2022).

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