형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

Summary

본 프로토콜에서, 형광단-보조 탄수화물 전기영동(FACE) 기술은 글리코겐의 사슬 길이 분포(CLD) 및 평균 사슬 길이(ACL)를 결정하는데 사용된다.

Abstract

글리코겐 입자는 α-1,4 글루코시드 결합에 의해 연결된 글루코실 단위의 선형 사슬로 구성된 분지형 다당류이다. 후자는 분지점으로 지칭되는 α-1,6 글루코시드 결합에 의해 서로 부착된다. 다양한 형태의 탄소 저장 (즉, 전분, β-글루칸) 중에서 글리코겐은 아마도 살아있는 세계에서 발견되는 가장 오래되고 성공적인 저장 다당류 중 하나 일 것입니다. 글루칸 사슬은 필요할 때 다량의 포도당을 세포에 신속하게 저장하거나 연료를 공급할 수 있도록 조직됩니다. 글리코겐 입자의 미세 구조를 해결하기 위해 지난 수십 년 동안 수많은 보완 기술이 개발되었습니다. 이 기사에서는 형광단 보조 탄수화물 전기 영동 (FACE)에 대해 설명합니다. 이 방법은 글리코겐 입자를 구성하는 글루칸 사슬의 집단을 정량화합니다. CLD(체인 길이 분포)라고도 하는 이 매개변수는 입자 크기와 분지화 백분율을 반영합니다. 또한 글리코겐 생합성의 수학적 모델링에 필수적인 요구 사항입니다.

Introduction

탄소 및 에너지 저장으로 사용되는 글리코겐은 (1 → 4)-α 결합에 의해 연결되고 (1 → 6) – α 글리코시드 결합 또는 분지 점을 통해 부착 된 글루코실 단위의 선형 사슬로 구성된 글루코스의 단독 중합체입니다. 그들은 광범위한 유기체의 시토졸에서 β 및 α 입자로 나타납니다. β-입자는 원핵생물에서 주로 관찰되는 작은 수용성 입자이다. 그들의 직경은 20-40 nm이며, 글리코겐 대사 효소와 입체 장애 ^1,2에 의해 지시 될 가능성이 큽니다.

동물 세포에 처음 설명된 α 입자는 콜리플라워 모양의 직경이 최대 300nm까지 표시됩니다. 이러한 특정 조직은 여러 β-입자의 응집으로부터 기원될 수 있거나, 단일 β-입자(³)로부터 싹트면서 발생할 수 있다. 흥미롭게도, 최근의 한 연구는 에스케리치아 콜라이 ⁴에서 α 입자의 존재를보고했다. 그러나, 동물 세포로부터의 α 입자와는 달리, 후자는 추출 과정 동안 빠르게 분해되며, 이는 문헌⁴의 데이터 부족을 설명할 수 있다. 진핵생물과 원핵생물에서 α-입자의 출현은 계통유전학적으로 관련되지 않은 글리코겐 대사 효소⁵를 포함한다. 이것은 이러한 입자의 기능 및 β-입자⁵ 사이의 잠재적인 가교결합제의 성질에 관한 질문을 제기한다.

글리코겐 분자 형성 6,7,8,9에 대해 두 개의 상반되는 수학적 모델이 제안되었지만^, β 입자는 다량의 포도당의 신속한 방출을위한 매우 효율적인 연료 예비물로서 대사 기능에 반응하여 진화했다는 것이 일반적으로 받아 들여지고 있습니다. 큰 증거는 소화성 및 물에 대한 용해도와 같은 글리코겐 특성이 평균 사슬 길이 (ACL)와 상관 관계가 있음을 나타내며, 이는 분지점의 비율과 입자 크기 2,6,7,8,10,11을 지시합니다. . ACL은 글루코스 잔기의 총 수와 분지점의 수 사이의 비에 의해 정의된다. 전형적으로, ACL 값은 진핵생물 및 원핵생물에서 각각 11-14 및 7-23 글루코스 잔기로부터 각각¹⁰으로 다양하다. 인간에서, 몇몇 글리코겐 장애 질환은 비정상적인 글리코겐 축적으로 인한 것이다. 예를 들어, 안데르센병은 글리코겐 분지화 효소의 결핍된 활성과 연관되어, 비정상적인 글리코겐¹¹의 축적을 초래한다. 원핵생물에서, 누적 연구는 ACL이 글리코겐의 분해 속도 및 박테리아 생존 능력^12,13에 영향을 미치는 중요한 인자임을 시사한다. 낮은 ACL 값을 가진 β 입자를 합성하는 박테리아는 더 천천히 분해되어 기아 조건을 더 오래 견뎌내는 것으로 보고되었습니다. 따라서, β입자의 구조에 대한 지식은 인간 글리코겐 저장 질환에서 비정상적인 글리코겐 입자의 형성과 영양소가 결핍된 환경에서의 원핵생물 생존을 이해하는 데 필수적이다.

¹⁴세기 후반 프랑스 생리학자 클로드 베르나르(Claude Bernard)에 의해 개 간에서 글리코겐을 처음 분리한 이후, 글리코겐 입자를 자세히 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었다. 예를 들어, 글리코겐 형태학을 위한 투과 전자 현미경 (α- 또는 β-particles)¹⁵, α-1,6 결합의 백분율을 결정하기 위한 양성자-NMR 분광법¹⁶, 분자량을 추론하기 위한 다중 검출기를 사용한 크기 배제 크로마토그래피, 형광단-보조 탄수화물 전기영동 (FACE)¹⁷ 또는 사슬 길이 분포 (CLD) 및 ACL 둘 다에 대한 펄스 양파 검출 (HPAEC-PAD)을 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 결정¹⁸.

이 연구는 형광단 보조 탄수화물 전기 영동 방법에 초점을 맞추고 있으며, 이는 일차 아민 기능에 의한 hemiacetal 그룹의 환원적 아민화에 의존합니다. 역사적으로, 8-아미노-1,3,6-나프탈렌 트리술폰산 (ANTS)이 표지에 처음 사용되었습니다. 나중에, 보다 민감한 형광단, 8-아미노 1,3,6-피렌 트리술폰산(APTS)¹⁹로 대체되었다.

도 1: 8-아미노 1,3,6-피렌 트리술폰산(APTS)을 사용한 환원적 아민화 반응. 환원적 조건하에서 8-아미노 1,3,6-피렌 트리술폰산(APTS)의 일차 아민 기능에 의한 헤미아세탈 그룹의 환원적 아민화 반응은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 1에 묘사된 바와 같이, 글루칸 사슬의 환원 말단의 hemiacetal 기능은 환원 조건 하에서 APTS의 일차 아민과 상호작용한다. APTS의 술폰기는 중합도 (DP)에 따라 글루칸 사슬의 분리를 가능하게하는 음전하를 운반합니다. 환원성 아민 반응은 재현성이 높고 효율적이다. DP3 내지 DP135에 대해 80%의 평균 효율 라벨링이 얻어지고, 말토스(DP2) 및 글루코오스에 대해 각각 최대 88% 및 97%가^17,20으로 얻어진다. APTS의 한 분자가 각 글루칸 사슬의 환원 말단과 반응하기 때문에, 개별 사슬은 몰 기준으로 정량화되고 서로 비교될 수 있었다.

Protocol

1. 탈분기 효소와의 인큐베이션 0.5-2 mg/mL의 정제된 글리코겐 200 μL를 100 mM의 아세테이트 완충액 200 μL(pH 4.8)와 혼합하십시오. 2 μL의 이소아밀라아제 (단백질 180 U/mg)와 1.5 μL의 풀루라나제 (30 U/mg의 단백질)( 물질 표 참조)를 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고, 1.5 mL 튜브에서 16 시간 동안 42°C에서 인큐베이션한다.참고: 글리코겐 정제 과정 중에 분해 또는 아밀라아제 오염이 발생할 수 있습니다. 유리 말토올리고당의 존재를 평가하기 위해, 샘플은 분해 효소 칵테일 없이 병렬로 인큐베이션될 수 있다. 표준(예를 들어, 말토헵타오스)이 용출 시간과 중합 정도 사이의 관계를 결정하기 위해 분석에 포함된다. 95°C에서 5분 동안 인큐베이션하여 반응을 중지시킨다. 실온에서 5분 동안 16,100 x g 에서 원심분리하여 펠릿화하고 임의의 불용성 물질을 제거하였다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 새로운 주석이 달린 튜브로 옮깁니다. 음이온/양이온 교환 수지 비드(AG-501-X8, 표 참조)의 당량 100 μL 를 첨가하여 상층액을 탈염하고 교반한다. 정기적으로 5 분 동안 구슬을 동요시킵니다. 피펫팅으로 샘플을 수집하고 새로운 주석이 달린 튜브에 놓습니다. 동결건조 또는 30°C에서 설정된 진공 증발기( 표 참조)를 사용하여 샘플을 건조시킨다. 건조된 샘플을 실온 또는 -20°C에서 보관하십시오.참고 : 샘플은 1 개월 동안 저장할 수 있습니다. 2. 환원적 아민화 건조된 샘플을 테트라히드로푸란(THF) 중의 2 μL의 1 M 소듐 시아노보로하이드라이드와 2 μL의 APTS (15% 아세트산의 48 μL에 재현탁된 5 mg의 APTS)와 혼합 한다(물질의 표 참조). 어둠 속에서 16시간 동안 42°C에서 인큐베이션한다.주의: 소듐 시아노보로하이드라이드는 적응된 개인 보호 장비와 화학 후드 아래에서 취급됩니다. 흡입과 피부와의 접촉은 독성이 강하고 치명적일 수 있으며 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 매우 독성이 강한 가스는 시아노보로하이드라이드 나트륨과 아세트산을 혼합할 때 생성될 수 있습니다. 물과 접촉하여, 나트륨 시아노보로하이드라이드는 가연성 가스를 방출하며, 이는 자발적으로 발화될 수 있다. 농축 된 샘플은 화학 후드 아래에서 처리되며이 단계부터 적응 된 개인 보호 장비를 사용합니다. 3. 얼굴 분석 46 μL의 초순수를 각 샘플에 첨가한다. 샘플을 49 μL의 초순수에 1 μL의 샘플을 첨가하여 100 μL의 마이크로 바이알에서 1/50으로 직접 희석하십시오. FACE를 설정하는 동안 샘플을 어둠 속에 보관하십시오 (5-10 분). 레이저 유도 형광(LIF) 검출기를 사용하여 모세관 전기영동 장비로 역극성 전기영동을 수행합니다( 자료 표 참조). 분리를 위해 극성을 “역방향 모드”로 설정하고 LIF를 488nm 방출 파장으로, 검출기를 512nm로 설정합니다. 주입 시간을 10초로 설정하고 주입 압력을 0.5psi로 설정합니다. 초순수에서 1/3으로 희석된 N-연결된 탄수화물 분리 완충액에서 내경 50 μm(375 μm 외경)를 갖는 길이 60.2 cm의 베어 용융 실리카 모세관에서 30 kV에서 APTS 라벨링된 글루칸 분리를 수행 한다(표 참조).참고: N-연결된 탄수화물 분리 완충액은 20회 실행마다 교체됩니다. 4. 데이터 처리 내보내기 “. ASC “및 “. CDF “각각 일렉트로페로그램 프로파일 및 통합 데이터를 포함하는 파일. 를 엽니다 . ASC 파일은 시간 차트에 따라 상대 형광 단위를 그린다. 를 엽니다 . CDF 파일, 첫 번째 자동 통합을 진행하고 다음 매개 변수를 조정하십시오 : 너비; 계곡 통합에 계곡; 최소 면적. 부적절한 통합 이벤트를 수동으로 확인하고 수정하십시오.

Representative Results

글리코겐의 평균 사슬 길이의 결정그림 2는 글리코겐의 사슬 길이 분포 및 평균 사슬 길이(ACL)를 추론하는 데 필요한 워크플로우를 나타낸다. 그림 2: CLD(체인 길이 분포)와 평균 체인 길이를 결정하는 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3은 상업적 말토헥사오스 및 탈분지된 소 간 글리코겐의 전기페로그램을 표시한다. 모든 실험에서 4.13-4.67분 사이에 관찰된 형광 신호는 미반응 APTS로부터 유래하였다. 표지된 말토헥사오스(DP6)의 용출 시간은 8.49분으로 추정되었다(도 3A). 소 글리코겐의 APTS 표지된 글루칸을 DP6의 용출 시간에 기초하여 동정하였다(도 3B). 대조군 샘플(탈분기 효소와 함께 배양되지 않은 글리코겐)에서 유리 말토올리고당의 흔적이 검출되지 않았다(도 3C). 도 3: 표준 및 소 간 글리코겐의 일렉트로페로그램. (A) 글루칸 표준물질인 말토헥사오스(DP6)의 용출 시간(8.49분)은, 분해효소 활성의 작용 후 소 간 글리코겐으로부터 방출된 APTS 표지된 글루칸의 중합도(DP)를 확인하기 위한 기준자료로 사용하였다(B ). 인셋 패널은 최대 44DP의 글루칸 사슬의 분리를 보여줍니다. 병행하여, 처리되지 않은 소 글리코겐을 APTS로 표지하여 샘플 (C)에서 유리 말토 올리고당의 가능한 흔적을 검출하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. APTS 표지 글루칸의 방출은 이소아밀라아제 및 풀루라나제 활성 둘 다에 의한 분지점의 절단에 기인한다고 결론지을 수 있다. 모세관 전기 영동 프로파일은 여러 프로파일을 포함하는 모자이크 그림을 만들기 위해보다 적절한 형식으로 다시 그릴 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이를 위해 형광 값이 포함된 DATA 파일은 “asc” 확장자로 생성되고 CSV(쉼표로 구분된 값) 형식을 선택하여 스프레드시트 프로그램에서 열립니다. 불행하게도, 내보낸 형광 값은 상응하는 용출 시간과 연관되지 않는다. 따라서 FACE 장치의 획득 주파수 설정에 따라 수동으로 추가해야 합니다(4Hz는 0.25초마다 하나의 값 획득을 의미합니다). 그런 다음 피크 영역은 FACE 계측기의 기본 응용 프로그램을 사용하여 유추되거나 다른 응용 프로그램을 사용하기 위해 “cdf” 확장자를 가진 DATA 파일로 내보내졌습니다. 영역 값은 스프레드시트 프로그램에서 내보내고 DP를 전체 표면적의 백분율로 표현하여 정규화됩니다(그림 4). 그림 4: 데이터 정규화, 체인 길이 분포 및 평균 체인 길이 값. 형광 피크 영역을 스프레드시트에서 수입하고 정규화하였다. 사슬 길이 분포는 각 DP에 대한 DP의 백분율로 도시된다. 평균 사슬 길이(ACL)는 상응하는 중합 정도를 사슬 배의 각 백분율을 합산함으로써 계산된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 마지막으로, 평균 사슬 길이(ACL)는 상응하는 중합 정도를 곱한 각 백분율 사슬의 합을 계산함으로써 추론된다. 유사한 실험이 토끼 간 글리코겐 (도 5A), 소 간 글리코겐 (도 5B) 및 굴 글리코겐 (도 5C) 상의 삼중으로 수행되었다. 도 5: 상업적 글리코겐의 사슬 길이 분포. 토끼 간(A), 소 간(B), 및 굴 글리코겐(C)을 탈분기 효소(이소아밀라아제 및 풀루라나제)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 이어서, APTS 라벨링된 글루칸을 FACE 분석을 사용하여 이들의 중합도(DP)에 따라 분리하였다. 말토스(DP2), 말토헥사오스(DP6) 말토헵타오스(DP7)는 각각 토끼 간, 굴 및 소 간 글리코겐에서 가장 풍부한 글루칸을 나타낸다. 평균의 표준 오차 (SEM)는 세 가지 독립적 인 실험으로부터 추론되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 토끼 간 글리코겐의 사슬 길이 분포는 소 간 글리코겐(DP7) 또는 굴 글리코겐(DP6)보다 짧은 말토올리고당(DP2)의 함량이 더 높게 나타났다. 그 결과, 토끼 간 글리코겐은 소 간 글리코겐 (ACL = 11.9) 및 굴 글리코겐 (ACL = 12.6)에 비해 가장 낮은 평균 사슬 길이 (ACL = 9.8)를 가지고 있습니다. 이들 상업적 글리코겐은 글리코겐 포스포릴라제 또는 글리코겐 신타제 활성을 검정하는데 일반적으로 사용된다는 점에 유의해야 한다. 이는 글리코겐 대사 효소 활성의 동역학적 파라미터(Vmax 및 Km)의 결정이 글리코겐의 공급원에 따라 달라질 것임을 시사한다. 감산 분석감산 분석은 두 샘플의 글루칸 사슬 분포를 비교하는 간단한 방법입니다. 예를 들어, 야생형(WT) 시네코시스티스 PCC6803 균주 및 단일 원생성 glgA1 및 glgA2 돌연변이 균주에 의해 생산된 글리코겐 의 CLD가 결정되었다(도 6A). 도 6: 감산 분석을 이용한 사슬 길이 분포의 비교. (A) 시아노박테리아 균주로부터 정제된 글리코겐의 사슬 길이 분포: 야생형(WT) 시네코시스티스 PCC6803 및 단일 isogenic glgA1 및 glgA2 돌연변이 균주 는 FACE 분석을 사용하여 결정하였다. 평균의 표준 오차 (SEM)는 세 가지 독립적 인 실험으로부터 추론되었다. (b) WT의 각 DP의 %를 ΔglgA1의 각 DP의 %로 뺀 다음 WT의 각 DP의 %를 DP ΔglgA2의 각 DP의 %로 뺀 감산 분석을 수행하였다. 이 간단한 수학적 조작은 돌연변이 균주 (검은 선)에서 글루칸 사슬의 변화를 보여줍니다. (c) 야생형 및 시네코시스티스의 돌연변이체로부터의 글리코겐의 평균 사슬 길이 분포를 각 CLD (모든 샘플에 대한 DP6)에 대해 관찰된 최대 피크에 따라 정규화하였다. 두 성분은 정규화된 CLD를 로그 스케일(Nde(DP))로 플로팅함으로써 입증된다. 각 구성 요소는 성장 정지의 다른 메커니즘을 나타냅니다 (자세한 내용은 참조2 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 기억하자면, 대부분의 시아노박테리아 균주는 글리코겐 신타제 활성을 코딩하는 두 개의 유전자를 가지고 있다: GlgA1과 GlgA221. 두 효소 모두 ADP-글루코스의 잔여 글루코스를 선형 글루칸 사슬의 비환원 말단으로 전달한다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 사슬 길이 분포 프로파일만을 살펴봄으로써 샘플을 비교하는 것은 어려운 일이다. 감산 분석은 샘플 사이의 각 DP의 백분율을 뺀 것으로 구성됩니다 (그림 6B). WT의 %DP에서 DP ΔglgA1 돌연변이체의 %를 뺀 감산 분석은 DP3, 4 및 5 (음수 값)의 과잉과 DP 10-20의 감소된 함량을 보여준다. 대조적으로, WT의 %DP와 DP ΔglgA2 돌연변이체의 % 사이의 감산 분석은 반대 효과를 나타낸다. 감산 분석 프로파일이 GlgA1과 GlgA2 사이에서 다르기 때문에, 이것은 글리코겐 생합성21에서 각각의 글리코겐 신타제 이소형의 특정 기능을 시사한다. 감산 분석은 샘플과 병렬로 수행되는 기준 샘플을 포함하는 실험에만 적용 가능하다는 점에 유의해야 합니다. 그렇지 않으면, 감산 분석은 참조의 정규화된 CLD에 놓여 있기 때문에 경험적일 수 있다. 2015에서 Deng과 공동 연구자는 생쥐와 인간의 글리코겐 성장 정지 메커니즘을 조사했으며이 문제를 해결하기 위해 글리코겐 CLD를 대체 플로팅하고 해석하는 것을 제안했습니다. 이 플롯은 최대 피크 면적을 사용하여 각 CLD를 정규화합니다. 그런 다음 데이터는 두 구성 요소를 강조 표시하는 로그 배율로 플로팅됩니다. 후자는 사슬 신장 정지2에 대한 두 가지 다른 메커니즘을 보여줍니다. 더 높은 DP 컴포넌트에 피팅된 선을 그리면으로써, 절대 파라미터들(즉, 라인의 기울기 및 인터셉트들)이 기준 프로파일에 대한 정규화 없이 CLD 비교에 사용될 수 있다. 야생형(WT) 시네코시스티스 PCC6803 균주 및 단일 아이소제닉 glgA1 및 glgA2 돌연변이체 의 CLD를 로그 스케일로 플롯팅하고, 각 프로파일에 대해 피팅 라인을 결정하였다(도 6C). 첫 번째 성분은 샘플 간에 매우 유사했으며, DP 6에서 최대치로 정점을 찍었습니다. 이것은 분지화 효소가 명백하게 그러한 사슬의 최대치를 생성한다는 것을 예시한다. 두 번째 성분은 넓은 어깨로서 나타났고, 이는 이미 마우스 및 인간 글리코겐2에 대해 기술되었다. 두 번째 성분의 경사는 ΔglgA1에서 더 높은 DP에서 발생하였고, 상응하는 피팅 라인(적색 선)의 기울기는 야생형 프로파일보다 낮았다. 따라서, GlgA1의 결핍은 생합성 동안 사슬 신장의 정지를 늦추고, 이는 마우스 및 인간 글리코겐2에 대한 입체 장애에 의해 발생하는 것으로 제안되었다. 이러한 데이터는 남아있는 신장 효소 (즉, GlgA2)가 사슬 밀집 전에 더 긴 사슬을 생성한다는 것을 시사한다. Δ glgA2에서, 피팅 라인의 더 극적인 하락으로 반대 효과가 관찰되었으며, 나머지 GlgA1에 의해 생성 된 사슬이 입체 장애 전에 GlgA2 단독에 의해 합성 된 사슬보다 전체적으로 짧다는 것을 확증했다. 이 분석은 두 이소형이 뚜렷한 동역학을 가지고 있고 / 또는 분지화 효소 활성과의 각각의 협동성이 다르다는 것을 암시합니다.

Discussion

글리코겐 입자의 물리화학적 특성(예를 들어, 크기, 형태학, 용해도)은 입자를 구성하는 글루칸의 길이와 직접적으로 연관된다. 생합성 효소와 이화작용 효소 사이의 임의의 불균형은 사슬 길이 분포의 변화와, 그 자체로 세포(¹¹)에 대해 유해할 수 있는 비정상적인 글리코겐의 축적을 초래한다. FACE 분석은 글리코겐의 사슬 길이 분포(CLD)를 결정하기 위해 선택하는 방법입니다. 도 2에 묘사된 바와 같이, CLD의 결정은 글리코겐 입자의 구조를 미러링하는 글리코겐(ACL)의 평균 사슬 길이 값의 추론을 허용한다. 높은 ACL 값을 갖는 동물 글리코겐은 비정상적인 입자의 출현과 관련된다. 감산 분석은 서로 다른 유전 적 배경 (돌연변이 대 야생형)의 두 글리코겐 샘플을 비교하는 데 유용한 방법입니다. 반면에 최대 피크로 정규화된 CLD를 로그 스케일로 플로팅함으로써 CLD를 기준과 독립적으로 비교하고 성장하는 글리코겐 메카니즘에 대한 정보를 제공하였다.

또한, FACE 분석은 글리코겐 대사 효소의 촉매 특성을 특성화하는 강력한 기술이다. 예를 들어, 모든 글리코겐 분지화 효소는 (1 → 4)-α 결합을 절단하고, 올리고말토실기를 (1 → 6)-α 위치 또는 분지점 상으로 전달한다. 분지화 효소는 유사한 촉매 메카니즘(²²)에도 불구하고 다당류(예를 들어, 아밀로펙틴, 글리코겐)에 대한 친화도 및 전사된 글루칸의 길이로 인해 구별될 수 있다. 따라서, 분지화 효소의 다양한 공급원(인간, 식물, 박테리아)은 FACE 분석(²³)을 이용한 일련의 인큐베이션 실험 및 CLD 비교를 통해 특성화되고 분류될 수 있다.

소개에서 언급된 바와 같이, HPAEC-PAD는 또한 사슬 길이 분포⁽¹⁸)를 결정하기 위한 대안적인 방법이다. 두 기술 모두 중합도 (DP)에 따라 선형 글루칸 풀을 분리하기 전에 이소아밀라아제 유형 탈→ 효소에 의한 (1 α 6)- 결합 또는 분지점의 완전한 가수분해를 필요로 한다. 그러나, HPAEC-PAD 방법은 FACE에 비해 두 가지 단점을 가지고 있다: (1) 글루칸 사슬이 증가함에 따라 양파 펄스 응답이 감소하며, 이는 정량적 정보를 제공하지 않는다. 이러한 질량 바이어스 문제는 음이온 교환 컬럼과 PAD²⁴ 사이의 포스트 컬럼 효소 반응기를 포함하는 HPAEC-ENZ-PAD를 사용하여 회피할 수 있다. 컬럼 효소 반응기는 말토올리고당을 글루코스 잔기로 가수분해하여 일정한 펄스 앰페로메트릭 반응을 가능하게 합니다. (2) HPAEC-PAD는 최대 70의 중합도로 글루칸 사슬을 분리 할 수 있습니다. 분해능이 글리코겐 샘플의 CLD를 결정하기에 충분하지만, FACE는 전분 샘플¹⁷에 적합한 최대 150개의 DP로 사슬을 분리한다. HPAEC-PAD와 FACE 분석 모두 장단점이 있다는 것을 명심해야합니다. 예를 들어, 아민화 반응은 APTS의 일차 아민 기능과 반응하기 위해 자유 혈백혈 그룹을 필요로합니다. 이는 APTS 라벨링이 환원 말단이 결여된 글루칸 사슬(예를 들어, 이눌린)에 사용될 수 없음을 의미한다. HPAEC-PAD 방법은 말단 감소의 존재를 필요로 하지 않는다. HPAEC-PAD 방법의 두 번째 흥미로운 측면은 음이온 교환 컬럼에 몇 밀리그램의 선형 글루칸을 로딩 할 수있어 효소 분석^18,25를 위해 특정 DP 또는 ^14C방사성 표지 된 말토 올리고당으로 말토 올리고당을 정제 할 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 질량 분광법 (예를 들어, MALDI-TOF)이 사슬 길이 분포를 결정하는 빠르고 민감한 기술이지만,이 기술은 재현성이 떨어지는 것으로 보인다. 긴 글루칸 사슬의 양을 과대 평가한다(²⁶). 그럼에도 불구하고, 후자는 세포 조직⁽²⁷)에 걸쳐 글리코겐의 존재를 맵핑하기 위한 MALDI 영상화와 같은 특정 적용을 위해 사용될 수 있다.

Materials

AG-501-X8 Resin	BioRad	#1436424	Storage Room temperature
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8			Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature.
APTS stock solution	Merck	09341-5MG	Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C.
Capillary	Sciex Separations, Les Ulis, France
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623	Thermofisher		select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf  file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min.
Excel	Microsoft		Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or  Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.
Free-Dry apparatus	Christ	alpha 2-4 LO plus	before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h.
Isoamylase	Megazyme	E-ISAMY	180 U/mg of protein
Maltoheptaose	Merck	M7753
N-Linked carbohydrate separation buffer	Sciex Separations, Les Ulis, France	477623	Storage at 4 °C
Pullulanase	Megazyme	E-PULKP	30 U/mg of protein
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	296813-100ML	1 M Sodium cyanoborohydride in THF
Vaccum-evaporator	Eppendorf	Concentrator 5301	Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried