הפרוטוקול מתאר יצירת כדוריות בתפוקה גבוהה להדפסה ביולוגית באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של החמצון שלהם ומוות התאים שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. ניתן ליישם גישה זו כדי לשלוט בכדאיות הספרואידים ולבצע סטנדרטיזציה, החשובה במידול רקמה תלת-ממדית, מיקרו-סביבה של הגידול וביו-פבריקציה מוצלחת (מיקרו)של רקמות.
ספרואידים רב-תאיים הם כלים חשובים לחקר פיזיולוגיה של רקמות וסרטן בתלת-ממד ומשמשים לעתים קרובות בהנדסת רקמות כיחידות להרכבת רקמות לביו-פבריקציה. בעוד שהכוח העיקרי של מודל הספרואידים הוא בחיקוי גרדיאנטים פיזיקליים-כימיים בקנה מידה זעיר של הרקמה, בדרך כלל מתעלמים מהסביבה הפיזיולוגית האמיתית (כולל דינמיקה של פעילות מטבולית, חמצון, מוות תאי והתפשטות) בתוך הספרואידים. יחד עם זאת, ההשפעות של הרכב מדיום הצמיחה ושיטת ההיווצרות על הפנוטיפ הספרואידי שנוצר מתועדות היטב. לפיכך, אפיון וסטנדרטיזציה של פנוטיפ ספרואידי נדרשים כדי להבטיח את יכולת השכפול והשקיפות של תוצאות המחקר. הניתוח של חמצון ספרואידי ממוצע והערך של שיפועי O2 בשלושה ממדים (3D) יכול להיות דרך פשוטה ואוניברסלית לאפיון פנוטיפ ספרואידי, ולהצביע על הפעילות המטבולית שלהם, על הכדאיות הכוללת שלהם ועל הפוטנציאל לסיכום מיקרו-סביבה של רקמות in vivo . ניתן לשלב בקלות את ההדמיה של חמצון תלת-ממדי עם ניתוח מולטי-פאראמטרי של פרמטרים פיזיולוגיים נוספים (כגון מוות תאי, התפשטות והרכב תאים) וליישם אותה לניטור חמצון רציף ו/או למדידות נקודת קצה. ההעמסה של הגשושית O2 מתבצעת במהלך שלב היווצרות הספרואידים ותואמת לפרוטוקולים שונים של יצירת ספרואידים. הפרוטוקול כולל שיטת תפוקה גבוהה של יצירת ספרואידים עם הצגת ננו-סנסורים פלואורסצנטיים של O2 פלואורסצנטיים אדומים וקרובים לאדום ואינפרה-אדום ותיאור של הערכה מרובת פרמטרים של חמצון ספרואידים ומוות תאים לפני ואחרי ההדפסה הביולוגית. הדוגמאות הניסיוניות מראות ניתוח גרדיאנטים השוואתי של O2 בספרואידים הומו-תאיים והטרו-תאיים, כמו גם במבנים מודפסים ביולוגית מבוססי-ספרואידים. הפרוטוקול תואם למיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי בעל מספר מסננים פלואורסצנטיים ודיודה פולטת אור כמקור אור.
חמצן מולקולרי (O2) הוא אחד המטבוליטים המרכזיים המווסתים את הכדאיות, התפקוד והמוות של תאים ורקמות. בתנאים פיזיולוגיים, חמצון רקמות מקומיות מווסת באופן דינמי על ידי כלי דם של רקמות, זרימת דם וחילוף חומרים של תאים, ובמקרים מסוימים מובילים להיווצרות של גרדיאנטים O2, מיקרו-סביבה היפוקסית ו/או עקה חמצונית 1,2. התאים חשים את גרדיאנטים O2 באמצעות מעורבות ישירה של ה-O2 המולקולרי בתפקוד האיתות (באמצעות איתות בתיווך גורם היפוקסיה (HIF), איתות בתיווך היסטון ליזין דמתילאזות KDM, ובאמצעים אחרים), שינויים בפוטנציאל החמצן מחדש התאי (חישת מינים תגובתיים של O2 באמצעות איתות Nrf2/Keap1 או חלבונים מווסתי ברזל), ויכולים לאחר מכן להתאים את חילוף החומרים שלהם, התפשטות, עוצמה, והבחנה3. לפיכך, הטרוגניות של חמצון תאים ורקמות, גרדיאנטים שלה ותופעות נלוות הם שחקנים חשובים בהתפתחות רקמות והומאוסטזיס. רקמות וסוגי תאים שונים דורשים לעתים קרובות רמות שונות של O2 פיזיולוגיות ‘נורמליות’, המגדירות את ארכיטקטורת הרקמה המיוחדת עם תאים הממוקמים על פי הרקמה O2 microgradients4. סוגי תאים מסוימים רגישים לירידה ב-O2 (למשל, נוירונים, הפטוציטים, תאי איון הלבלב או תאי שריר)5,6, בעוד שאחרים יכולים לעמוד בהיפוקסיה קיצונית וליצור שיפועים תלולים של O2 (למשל, באפיתליה של המעיים והמעי הגס)7. עם ההתקדמות בביו-הנדסה של רקמות ובביו-פבריקציה, הצורך בכימות O2 במיקרו-אגרגטים ובמבנים תלת-ממדיים של רקמות תלת-ממדיות כדוריות הופך להיות חשוב. אחד החששות הוא סטנדרטיזציה של הפרמטרים הפיזיולוגיים של המודל הספרואידי הרב-תאי, התלויים בשיטת יצירת הספרואידים ותנאי התרבית8. בנוסף, יישום בלתי מבוקר של O2 המשחרר ביו-חומרים או O2 פרפוזיה במיקרוטיסים ללא כלי דם פונקציונליים יכול להיות רעיל לתאים, להוביל לתכנות מחדש של חילוף החומרים שלהם, ולפגיעה בהישרדות בתקופה שלאחר ההשתלה 9,10. האמינות של גישת המדידה O2 והאופטימיזציה של סביבת החמצון כדי להגיע לתרבית היעילה של מיקרו-אגרגטים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הוכחה לאחרונה על ידי מודלים מתמטיים של כדוריות כבד שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים המשמשים כדוגמה11. תחום נוסף בו מוכר הידע של רמות O2 של רקמות הוא טיפול בסרטן12,13. היפוקסיה של גידול הטרוגני עלולה לפגוע בטיפול מוצלח נגד סרטן. מדידה ובקרה של רמות החמצון המדויקות במהלך טיפול בחולה או מודלים של היפוקסיה בגידול יאפשרו שיפור של אסטרטגיות טיפול פרטניות ומותאמות אישית14. לפיכך, ניטור כמותי של חמצון דינמי במבנים ביו-פבריקטים ובמודלים של גידולים תלת-ממדיים הוא כלי בולט לניתוח פיזיולוגי של פעילות הנשימה שלהם, חילוף החומרים והאופטימיזציה של תרבית רקמה, תנאי ייצור או מחקרים בסיסיים של התגובה הטיפולית המתווכת בהיפוקסיה.
מספר שיטות מאפשרות ניתוח מרובה (או מרובה פרמטרים) של חמצון תאים במבני רקמות כדוריות ומיקרו-אגרגרטיות. חלוצה עם נוירוספרות וספרואידים של גידולים 15,16,17, הגישה המבוססת על מיקרוסקופיית הדמיה לכל החיים של זרחן (PLIM) מאפשרת כימות ישיר של חמצון תאים במיקרוטיסים חיים ולבסס את המתאם שלו עם כדאיות התאים, התפשטות או התפלגות סוגי התאים הפונקציונליים. למרות כוחה של הגישה, שדרוג המיקרוסקופיה של PLIM עדיין אינו זמין באופן נרחב אפילו בקרב ספקי המיקרוסקופיה הפופולריים18,19. למרבה המזל, מספר לא מבוטל של ננו-חלקיקים רגישים לתא O2 יכולים לשמש גם למצב מדידה יחסמטרי מבוסס עוצמה פלואורסצנטית 15,17,20,21,22,23,24. בדרך כלל, הגשושית תציג שני אורכי גל של פליטה, כלומר, O2-רגישים וחסרי רגישות (ייחוס), שניתן למדוד אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי, במצלמת סינון בעלת תוכן גבוה או בקורא מיקרו-פלטה. ננו-חלקיקים בעלי חישה של O2 יכולים להיות מיוצרים על ידי טכניקת משקעים עם הפולימרים הניתנים להתאמה ביולוגית, חישת O2 וצבעי ייחוס המשתרעים על ספקטרום גלוי ואינפרה-אדום קרוב, או שניתן לרכוש אותם באופן מסחרי 2,25. מאחר שניתוח של מיקרוטיזות תלת-ממדיות עבות ייהנה משימוש בצבעים פלואורסצנטיים בעלי תזוזה אדומה, נבנתה הגשושית הננו-חלקיקית היחסית O2-חישה רב-מודאלית אינפרה-אדום מספר 1 (MMIR1), המורכבת מ-PtTPTBPF 26 בעל חישה של O26 ומצביעי ייחוס aza-BODIPY27 הספוגים בקופולימר מבוסס פולימתקרילט טעון חיובית, נבנתה28. עם תכנון זה, אות O2 רגיש (קרוב אינפרא אדום, עירור (exc.) = 635 ננומטר, פליטה (em.) = 760 ננומטר; Isens) מושפע מהריכוז [O2] באמצעות תהליך מרווה של זרחן, בעוד שעוצמת צבע הייחוס האדום (exc. = 580 ננומטר, em. = 650 ננומטר; Iref) נשאר לא מושפע (איור 1A). לפיכך, יחסחישה Iref / I (R) בתאים מוכתמים יכול לאפשר כיול O2 22.
כאן, אנו מתארים גישה כמותית למחצה לניטור חמצון תאים חיים בספרואידים ובמבנים מודפסים ביולוגית, ומסייעים להעריך את שיפועי O 2 במדידות נקודתקצה וקינטיות. הדמיית O2 כזו יכולה להתבצע עם סוגים אחרים של בדיקות O2 יחסמטריות (איור 1B) ובהתאם למספר מקורות האור הזמינים ומסנני הפלואורסצנציה, ניתן להשתמש בה עם צבעים אחרים כדי לקבל מידע על תאים חיים/מתים, על תפקוד המיטוכונדריה ולעקוב אחר סוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש גם במצבי מדידה מתקדמים כגון מיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM)19. האתגר הגדול ביותר בשימוש בצבעי צביעת תאים ובננו-חלקיקים רגישים ל-O2 הוא האופטימיזציה של פרוטוקול ההכתמה. במקרה של הגשושית MMIR1 וננו-חלקיקים קשורים, התאים מוכתמים מראש או דוגרים יחד במהלך תהליך היווצרות הספרואידים. בפרוטוקול המתואר, ספרואידים מוכתמים בגשושית O2 נוצרו על משטח אגרוז בעל דבק נמוך 29,30,31,32 (איור 1C), מה שמאפשר הדפסה ביולוגית מבוססת-ספרואידים וניתוח מרובה פרמטרים של O2 ומוות תאים. כדי להמחיש את תחולת הגישה, הושוו רמות החמצון בספרואידים של תאי עיסת הומו-או הטרו-תאיים (שנוצרו עם תוספת של תאי אנדותל של וריד טבור אנושי, HUVEC) של תאי גזע של תאי עיסת שיניים אנושיים (hDPSC) לפני ואחרי ההדפסה הביולוגית, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי.
משמעות. מדידת חמצון רקמות מספקת תובנה על חילוף חומרים ספציפי לתאים ולרקמות, צמיחה והתפתחות של רקמות, כדאיות, גידולים סרטניים ונדידת תאים, ואינטראקציה עם חיידקים ופתוגנים אחרים. השיטה המוצגת נותנת כלי חדש להבנה טובה יותר של הפיזיולוגיה של תרביות ספרואידים רב-תאיות: ניתוח חמצון עם בדיקות ננו-חלקיקים יחסמטריות O2 ומספקת אמצעים להערכת היפוקסיה, המדמה את ההסתמכות על מסלולי ייצור אנרגיה מסוימים ומשלימה מחקרי מידול וגישות הדמיה מטבוליות חלופיות43,44 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעלות נמוכה הזמין באופן נרחב. מדידות רציומטריות יכולות להתבצע על שדה רחב פלואורסצנטי (עדיף עירור LED פועם), קונפוקל לסריקת לייזר, יריעת אור ומיקרוסקופים דו-פוטונים, המצוידים באופן אידיאלי בתאי אינקובטור T ו- O2. חשוב לציין שמדידת המיקרוסקופיה O2 המוצגת ניתנת לשילוב בקלות עם ניתוח רב-פרמטרים חיים של פרמטרים פיזיולוגיים שונים ומעקבי תאים (במקרה של תרביות כדוריות הטרו-תאיות), כדאיות (צביעה חיה/מתה), חילוף חומרים של שומנים (בדיקות פלואורסצנטיות עם חישת שומנים), דינמיקה של pH (צבעים, ננו-חלקיקים וחלבונים פלואורסצנטיים) או [Ca2+ ], מבוצע בתעלות ספקטרליות פלואורסצנטיות זמינות או במקביל, תוך מתן מבט מורחב על תפקוד התא בזמן אמת בספרואידים, מבנים מודפסים ביולוגית והשתלות רקמות פוטנציאליות.
תרביות ספרואידיות מוצאות שימוש במחקרים על תאים סרטניים, מיקרו-סביבה של נישה של גידולים ותאי גזע, גידולים סרטניים, יעילות תרופות ובדיקת רעילות, ואכן כאבני בניין רקמה לביו-פבריקציה של רקמות והרכבה עצמית45. הם יכולים להיווצר ממספר סוגי תאים על ידי מגוון גישות שונות46. הפופולריות של המודל הספרואידי מחייבת את הסטנדרטיזציה שלהם מנקודת המבט של שלמות המחקר ושיפור ניתוח הנתונים, אשר נוסה לאחרונה על ידי פיתוח של מסד הנתונים הספרואידי הראשון8.
הפרוטוקול שלנו צפוי לעזור להבין טוב יותר את חילוף החומרים של הספרואידים החיים, לתקנן את המודל הניסיוני הזה, ובהמשך לשפר את היציבות, יכולת השכפול והכדאיות שלהם לטווח הארוך בתוך חומרים מודפסים ביולוגיים ומושתלים.
שינויים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במשטח אגרוז בעל דבקות נמוכה (היווצרות מבוססת מיקרומולד29) לייצור תפוקה גבוהה של ספרואידים עמוסי גשושיות O2 לניתוח חמצון. השיטות החלופיות לייצור כדוריות כגון טיפה תלויה, יישום של לוחות חיבור נמוכים במיוחד, ציפוי שומנים או היווצרות צפה בחופשיות תואמות גם הן לפרוטוקול העמסת הגשושית O2 המוצע. הפרוטוקול שהוצג היה מותאם לספרואידים hDPSC ולספרואידים מתרבית משותפת של hDPSC עם HUVEC (1:1). קווי תאים אחרים בהחלט ישימים 15,17,47,48; עם זאת, ייתכן שתידרש אופטימיזציה מסוימת של הפרוטוקול בשל תכונות הידבקות התא השונות, תנאי התרבית, דרישות המצע המטבולי ותאימות התאים עם צביעת ננו-חלקיקים. הבחירה בגשושית מתאימה מבוססת ננו-חלקיקים יחסית O2-רגישה צריכה להיעשות בהתאם למודל התא הספציפי ועל פי תכונות הפוטו-הלבנה של הגשושית במערך המיקרוסקופיה המשומש (עוצמת וסוג מקור האור, הרגישות הספקטרלית של המצלמה) וזמינותם של מסנני עירור/פליטה מתאימים לייחוס תואם וערוצים ספקטרליים רגישים ל-O2 של הגשושית.
חלק מהגשושיות היחסיות O2 זמינות מסחרית2. לחלופין, ניתן להכין אותם בתוך הבית על ידי משקעים משותפים של ייחוס וצבעים רגישים ל-O2 עם פולימר כמתואר במקום אחר 24,25,49. עבור כל מודל בנפרד, הבדיקות הראשוניות צריכות להיעשות על מנת לקבוע את הבדיקה המתאימה ואת תנאי המיקרוסקופיה האופטימליים ולמזער את ההשפעה של הלבנת תמונות של בדיקה או צריכת O2 פוטואינדוצית במהלך מדידות יחסמטריות. מחקרים קודמים על ננו-חלקיקים בעלי חישת O2 הדגימו את רעילותם הנמוכה של התאים, ואפשרו יישום במגוון רחב של ריכוזי צביעה (1-20 מיקרוגרם/מ”ל). מכיוון שחלק מהננו-חלקיקים הקטיוניים יכולים לצבור את עצמם במהלך האחסון, אנו ממליצים לשמור על ריכוז ההעמסה שלהם נמוך ככל האפשר כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית שלהם על היווצרות הספרואידים. לחלופין, ניתן לסנן את תרחיף הננו-חלקיקים (0.2 מיקרומטר) או לנקותו על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם, 5 דקות) לפני השימוש כדי להסיר את כל האגרגטים מההשעיה.
למרות שתוכנת BioCAD ו- HMI הן ספציפיות עבור הביופרינטר המוצג, פרוטוקול זה חל על מדפיסים ביולוגיים אחרים, שכן מסופקים הכנת הביואינק, ההרכבה, מילוי מחסנית סטנדרטית והתכנון של פיגום הידרוג’ל נקבובי. יתר על כן, הפרמטרים של הדפסה ביולוגית כגון קצב הדפסה וטמפרטורה צריכים להיות דומים עבור מדפיסים ביולוגיים שונים המבוססים על שחול. לחץ ההדפסה וקוטר התמוכת תלויים בסוג המחט ובקוטר, בהרכב הביואינק, בטמפרטורה ובצמיגות הנובעת מכך, אך הם יכולים להוות נקודת התחלה לאופטימיזציה של פרמטרי ההדפסה לביו-אינקים מבוססי GelMA עם ביו-פרינטרים שונים, אם כי חלק מהביו-פרינטרים משתמשים בצירים במקום בלחץ אוויר כדי להוציא את הביופיאנק50.
שלבים קריטיים ופתרון בעיות. אחד השלבים הקריטיים הוא הבחירה בגשושית O2 , המבוססת על השיקולים הבאים: ראשית, מערך המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הזמין (כלומר, מקור אור עירור תואם, מסננים לעירור ופליטה, רגישות למצלמה ושידור ספקטרלי וצמצם מספרי של המטרה), שיכול להגביל את מספר הגשושיות הזמינות ביחס ליציבות הצילום שלהן, בהירות ופוטוטוקסיות פוטנציאלית. חשוב גם לציין כי סוגים מסוימים של שמן טבילה (במקרה של מטרות טבילת שמן) יכולים להפריע לאותות פלואורסצנטיים אדומים ואינפרה-אדומים. אנו רואים את מבחני הצילום כחשובים ביותר וכי יש לבצע אותם במהלך ההקמה הראשונית והבדיקות המקדימות. יש לקחת בחשבון הצלבה ספקטרלית פוטנציאלית בין הערוצים הפלואורסצנטיים לצבעים שונים. ואכן, יש להעריך את הרעילות הכהה והפוטו-אינדוקטיבית הפוטנציאלית של הגשושית O2 ושל צבעים נבחרים אחרים, ביחס למודל התא הספציפי, במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול51. הבעיה הספציפית עבור ננו-חלקיקים יכולה להיות הצבירה העצמית שלהם, אותה ניתן למתן על ידי אופטימיזציה של ריכוז העבודה שלהם, הרכב מדיום הכתם (למשל, תכולת הסרום), סוניזציה של ננו-חלקיקים לפני ערבוב עם תווך או על ידי שימוש בתאים מוכתמים ושטופים מראש של גשושית O2 להיווצרות ספרואידים במקום העמסת גשושית במהלך היווצרות הספרואידים והליך הדחיסה.
לא הבחנו בבעיות הקשורות לעומק חדירת האור עם מודלים ספרואידיים מתוארים, אך יש לקחת זאת בחשבון בעת בחירת אותות עוצמה יחסמטריים, גודל של מבנים ספרואידיים וביו-פבריקטים (שתלי רקמות) ואופטימיזציה של צביעת תאים בצבעים המתאימים. גשושית MMIR1 בעלת אורכי גל של פליטת אדום וקרוב-אינפרה-אדום תואמים היטב צפויה לספק את הרקע הנמוך ביותר ואת חדירת אור הרקמות הטובה ביותר, בהשוואה לבדיקות ביוסנסור פלואורסצנטיות אחרות הפולטות אדום/כחול או ירוק.
ייצור וטיפול בתמונות יחס (וייתכן שביטול ספקטרלי או דה-קונבולוציה) יכולים להיעשות בתוכנה המסופקת על ידי ספק או באפשרויות openource כגון ImageJ, פיג’י52,53, napari (https://napari.org), MATLAB ואחרים. שלב קריטי יהיה בהפחתת הרקע ובמדידת שינויים בעוצמת האות בטווח ליניארי.
כיול של גשושית O2: רוטנון ואנטימיצין A הם מעכבים של קומפלקסים I ו-III של שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית, בהתאמה, חוסמים את הנשימה שלהתאים 54,55,15 וגורמים לפיזור של שיפועים O 2-גרדיאנטים בספרואידים ושיווי משקלם עם O 2 הסביבתי. לפיכך, שינוי הריכוז הסביבתי O2 (כלומר, 20%, 15%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0% O2) יאפשר כיול עוצמה יחסית או כיול חיי זרחן של הגשושית הרגישה O2 בתאים. בדרך כלל, חממות מבוקרות O2 אינן מסוגלות להשיג 0% O2 מוחלט ובמצבים מסוימים, נדרשת בדיקה מהירה של תגובה של בדיקה לדיאוקסיגנציה. במקרים כאלה, 25-100 מיקרוגרם / מ”ל של גלוקוז אוקסידאז או Na2SO3/K2HPO4 תערובת (50 מ”ג / מ”ל עבור כל תרכובת עבור תמיסה 10x במים מזוקקים) יש להוסיף לדגימה. חשוב לציין שאם לקו התאים יש מידה משמעותית של צריכת O2 שאינה מיטוכונדריאלית, קחו זאת בחשבון בעת ביצוע עיכוב של ניסויי נשימה וכיול.
מגבלות ומחקר עתידי. המגבלה העיקרית של השיטה המוצעת והזיהוי היחסי באופן כללי, היא הכיול וההמרה של רמות היחס הנצפות לרמות O2 בפועל, אשר בשל הבדלים מהותיים בהגדרות רכישת החומרה ותמונת המשתמש יהפכו את כיול היחס למכשיר ספציפי לתא. חשוב לציין, עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה והגדרה מתוארת, תמונות היחס משקפות הקרנות משולבות ולא מקטעים אופטיים אידיאליים וכיול O2 לא יהיה הגיוני. מאידך גיסא, אנו מראים כי מדידות יחסים כמותיות למחצה מספקות פנוטיפ השוואתי מובהק סטטיסטית וקל למדידה של ספרואידים המופקים ממקורות שונים ויש להם הבדלים בחמצון.
המחקר העתידי ביצירת גישות מיקרוסקופיה נגישות ומשתלמות יותר המיועדות לעצמים תלת-ממדיים חיים כגון SPIM, יריעת אור, תטא, הדמיה לכל החיים של שני פוטונים ולומינסנציות בשילוב עם למידת מכונה 56,57,58,59,19, יסייעו בהבאת הדמיית O 2 רב-פרמטרית ליישומים כמותיים עוד יותר.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר המיוחדת של אוניברסיטת גנט (BOF / STA / 202009 / 003) ותוכנית FP7 ITN של האיחוד האירופי “Chebana”, הסכם מענק מס ‘264772 (עבור AVK). הנתונים זמינים על פי בקשה. קוד G להדפסה ביולוגית זמין לשיתוף.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3cc Cartridge, UV secure, luer lock | RegenHU | C-033CC-UV | Also available from CelIink and others |
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | N/A | Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12) |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
B-Braun Tip Cap, luer lock | RegenHU | TC-BB-B | Also available from Regemat, Cellink and others |
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile | Greiner bio-one | 627861 | For microscopy of bioprinted spheroids |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Also available from Lonza and others |
Endothelial Growth SupplementMix | PromoCell | C-39216 | Also available from Lonza and others |
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | Used as mitochondrial uncoupler |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma |
GelMA | N/A | N/A | GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx |
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) | Sigma-Aldrich | G7141 | Used to test the response of probe to deoxygenation |
GlutaMAX 100x Supplement | Gibco | 35050-038 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM) |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Hoechst 34580 | Invitrogen (Life Technologies) | H21486 | Also available from Sigma, BDBiosciences and others |
Human dental pulp stem cells (hDPSC) | Lonza | PT-5025 | Also available from ATCC or other vendors |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2517 | Also available from ATCC or other vendors |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) | Merck | 4873 | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
Li-TPO | N/A | N/A | Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma |
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium | Gibco | 32561-029 | Also available from Sigma and others |
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 | Self-fabricated | These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit) | |
Na2SO3 (sodium sulfite) | Sigma-Aldrich | 239321-500G | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ | N/A | N/A | Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ] |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100 |
Petri dishes, sterile | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Piston for 3cc cartridge | RegenHU | P-03CC-UV | Also available from Cellink, Regemat and others |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SYTOX Green | Invitrogen (Life Technologies) | S7559 | Also available from Sigma, Promega and others |
Taper tip 22 gauge (conical PE needle | Amada Myachi Europe | 22K62222 | Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others |
Tissue culture flask (75 cm2) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |