Saggio meccanico di prevenzione dei conflitti per misurare il comportamento del dolore nei topi

Summary

Il test meccanico di evitamento dei conflitti viene utilizzato come lettura non riflessiva della sensibilità al dolore nei topi che può essere utilizzata per comprendere meglio le risposte affettivo-motivazionali in una varietà di modelli di dolore murino.

Abstract

Il dolore comprende sia le dimensioni sensoriali (nocicettive) che affettive (spiacevoli). Nei modelli preclinici, il dolore è stato tradizionalmente valutato utilizzando test riflessivi che consentono inferenze riguardanti la componente nocicettiva del dolore, ma forniscono poche informazioni sulla componente affettiva o motivazionale del dolore. Lo sviluppo di test che catturino questi componenti del dolore è quindi importante dal punto di vista della traduzione. Quindi, i ricercatori devono utilizzare saggi comportamentali non riflessivi per studiare la percezione del dolore a quel livello. L’evitamento meccanico dei conflitti (MCA) è un test volontario di comportamento non riflessivo stabilito, per studiare le risposte motivazionali a uno stimolo meccanico nocivo in un paradigma a 3 camere. Un cambiamento nella preferenza di posizione di un topo, di fronte a stimoli nocivi concorrenti, viene utilizzato per dedurre la sgradevolezza percepita della luce intensa rispetto alla stimolazione tattile delle zampe. Questo protocollo delinea una versione modificata del test MCA che i ricercatori del dolore possono utilizzare per comprendere le risposte affettivo-motivazionali in una varietà di modelli di dolore murino. Sebbene non siano specificamente descritti qui, i nostri dati MCA di esempio utilizzano l’adiuvante di Freund completo intraplantarare (CFA), la lesione nervosa risparmiata (SNI) e un modello di frattura / fusione come modelli di dolore per illustrare la procedura MCA.

Introduction

Il dolore è un’esperienza complessa con componenti sensoriali e affettive. Una riduzione della soglia di percezione del dolore e l’ipersensibilità agli stimoli termici e/o meccanici sono caratteristiche chiave di questa esperienza, che i test di comportamento del dolore evocati dallo stimolo possono catturare (come il test di sensibilità al calore di Hargreaves e il test di von Frey di sensibilità meccanica)^1,2. Sebbene tali test forniscano risultati robusti e riproducibili, sono limitati dalla loro dipendenza dal ritiro riflessivo da uno stimolo nocivo percepito. Ciò ha messo in discussione una continua dipendenza della ricerca sul dolore solo su questi test. A tal fine, i ricercatori del dolore hanno esplorato per diversi anni test comportamentali alternativi / complementari da utilizzare nei modelli di dolore dei roditori nel tentativo di catturare più componenti affettive e / o motivazionali del dolore. Queste misure non evocate, volontarie o non riflessive (ad esempio, corsa delle ruote, attività di scavatura, preferenza del luogo condizionato ^3,4,5) vengono implementate nel tentativo di migliorare la traducibilità della ricerca preclinica sul dolore.

Il test di prevenzione meccanica dei conflitti (MCA) è stato originariamente descritto da Harte et al. nel 2016⁶, è usato prevalentemente nei ratti ^7,8 e rappresenta una modifica di un approccio precedente – il paradigma di fuga-evitamento del luogo. In questo approccio, uno stimolo nocivo della zampa posteriore viene eseguito in una camera (scura) altrimenti desiderabile per guidare il comportamento intenzionale dell’animale a sfuggire / evitare tale stimolazione ^9,10. Invece di fare affidamento sulla stimolazione nociva manuale della zampa posteriore da parte di un osservatore, il test MCA costringe i topi a negoziare uno stimolo potenzialmente nocivo per sfuggire a un ambiente avverso e raggiungere la camera oscura. Il conflitto/evitamento che dà il nome al saggio nasce da queste due motivazioni in competizione: fuggire da zone illuminate ed evitare la stimolazione nociva delle zampe. Il test MCA condivide anche le caratteristiche con il test condizionato delle preferenze di luogo, in cui l’abbinamento di sollievo dal dolore con segnali ambientali guida cambiamenti nel comportamento che riflettono una preferenza per il contesto antidolorifico / gratificante¹¹.

Fondamentalmente parlando, tutti questi saggi condividono un approccio simile: utilizzare uno spostamento nella preferenza di un animale per un ambiente avversivo rispetto a un altro come indicatore del loro stato affettivo / motivazionale. Il test MCA è un paradigma a 3 camere costituito da una camera illuminata seguita da una camera centrale scura con sonde ad altezza regolabili e una terza camera scura senza stimoli avversi. Un topo illeso è tipicamente motivato a fuggire in una camera oscurata, data l’innata avversione dei roditori alla luce intensa¹². In questo esempio, la motivazione naturale a fuggire da un ambiente illuminato supera la riluttanza a incontrare la stimolazione della zampa posteriore (le sonde di altezza regolabili), che si verifica esclusivamente nell’ambiente oscurato. Al contrario, un topo che avverte dolore (a causa di infiammazione o neuropatia, ad esempio) può scegliere di trascorrere più tempo nell’ambiente illuminato, poiché vi è la motivazione per evitare la spiacevole esperienza tattile delle sonde meccaniche nell’impostazione di ipersensibilità tattile in corso.

In questo articolo viene descritta una versione modificata del test MCA. Abbiamo adattato il metodo originale (che è stato eseguito nei ratti⁶) per l’uso nei topi. Abbiamo anche ridotto il numero di altezze della sonda testate da sei a tre (0, 2 e 5 mm sopra l’altezza del pavimento) al fine di semplificare l’acquisizione dei dati. Questo approccio è stato testato su più modelli di dolore e convalidato con analgesici noti, indicando che l’ipersensibilità al dolore e / o i cambiamenti affettivi e motivazionali associati stanno guidando questi cambiamenti nel comportamento. Questo approccio è relativamente veloce da condurre e adattabile rispetto ad altre misure non riflessive, che possono richiedere molti giorni di assuefazione e allenamento ^1,2. Di concerto con altre misure del dolore, MCA può generare preziose intuizioni sugli aspetti affettivi e motivazionali del dolore.

Protocol

Tutti gli esperimenti che coinvolgono l’uso di topi e le procedure ivi seguite sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l’uso degli animali del MD Anderson Cancer Center e della Stanford University, in stretta conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Costruzione MCA Camera di costruzione 1 con le seguenti dimensioni: 125 mm x 125 mm x 125 mm (larghezza x profondità x…

Representative Results

Il test MCA è stato utilizzato con successo con diversi modelli di dolore murino meccanicamente distinti. La Figura 2 mostra i dati in cui la misura del risultato scelta stava attraversando il punto medio della camera 2 (Figura 2A). I dati ottenuti utilizzando il punto intermedio rispetto alla fuga nella camera 3 sono molto simili, ~ 40 s per metà strada contro ~ 45 s per la fuga della camera 3 nel modello di danno nervoso risparmiato (SNI) del dolore neuropat…

Discussion

Come per tutti i test comportamentali, la corretta gestione, randomizzazione e accecamento al trattamento degli animali è essenziale in tutto. Dati gli input multifattoriali in comportamenti complessi e processi decisionali, è imperativo che gli animali siano maneggiati, abituati e testati nel modo più coerente possibile, riducendo al minimo l’angoscia. Bisogna anche fare attenzione a riprodurre i tempi di posizionamento del mouse nella camera 1, accendendo le luci a LED e rimuovendo la barriera, poiché le differenze…

Materials

32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red – 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White – 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.