Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados
Summary
El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras unidas a la membrana lipídica de tamaño nanométrico que se liberan de todas las células, están presentes en todos los biofluidos y contienen proteínas, ácidos nucleicos y lípidos que reflejan la célula madre de la que se derivan. La separación adecuada de los EV de otros componentes en una muestra permite la caracterización de su carga asociada y brinda información sobre su potencial como comunicadores intercelulares y biomarcadores no invasivos para numerosas enfermedades. En el estudio actual, los EV derivados de oligodendrocitos se aislaron de medios de cultivo celular utilizando una combinación de técnicas de vanguardia, incluida la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para separar los EV de otras proteínas extracelulares y complejos de proteínas. Utilizando columnas SEC disponibles comercialmente, los EV se separaron de las proteínas extracelulares liberadas de las células de oligodendroglioma humano bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y de control. Los marcadores canónicos de EV CD9, CD63 y CD81 se observaron en las fracciones 1-4, pero no en las fracciones 5-8. GM130, una proteína del aparato de Golgi, y calnexina, una proteína integral del RE, se utilizaron como marcadores EV negativos, y no se observaron en ninguna fracción. Además, al agrupar y concentrar las fracciones 1-4 como la fracción EV, y las fracciones 5-8 como la fracción de proteína, se observó la expresión de CD63, CD81 y CD9 en la fracción EV. La expresión de GM130 o calnexina no se observó en ninguno de los tipos de fracción. Las fracciones agrupadas de las condiciones de estrés de control y ER se visualizaron con microscopía electrónica de transmisión y se observaron vesículas en las fracciones EV, pero no en las fracciones de proteínas. Las partículas en el EV y las fracciones de proteínas de ambas condiciones también se cuantificaron con análisis de seguimiento de nanopartículas. Juntos, estos datos demuestran que SEC es un método eficaz para separar los EV de los medios de cultivo celular condicionados.
Introduction
La explosión de interés en el estudio de vesículas extracelulares (EV) ha ido acompañada de importantes avances en las tecnologías y técnicas utilizadas para separar y estudiar estas partículas heterogéneas de tamaño nanométrico. En el tiempo transcurrido desde su descubrimiento hace casi cuatro décadas1,2, se ha encontrado que estas pequeñas estructuras membranosas contienen lípidos bioactivos, ácidos nucleicos y proteínas, y desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular 3,4. Los EV se liberan de todos los tipos de células y, por lo tanto, están presentes en todos los fluidos biológicos, incluidos el plasma sanguíneo y el suero, la saliva y la orina. Los EV dentro de estos fluidos son muy prometedores para servir como biomarcadores no invasivos para diversas enfermedades, incluidas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas, cánceres y trastornos autoinmunes 5,6,7. Además, se pueden realizar estudios mecanicistas in vitro mediante técnicas de cultivo celular separando las EV liberadas en el medio de cultivo 3,8,9.
Para comprender el papel de las EV en la fisiopatología de la enfermedad, es primordial una separación adecuada del líquido en el que se encuentran. El estándar de oro para la separación de EV ha sido durante mucho tiempo la ultracentrifugación diferencial (dUC)10, sin embargo, han surgido técnicas más sofisticadas para lograr una mejor separación de los EV de otros componentes extracelulares. Algunas de estas técnicas incluyen gradientes de densidad, fracción de flujo de campo asimétrico (A4F), citometría de flujo, inmunocaptura, precipitación de polietilenglicol y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)11,12,13. Cada técnica tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas; sin embargo, se ha demostrado que la SEC en particular separa los EV de los fluidos biológicos y los sobrenadantes de cultivo celular de manera bastante efectiva 8,14,15. SEC también tiene la ventaja adicional de ser relativamente sencillo y fácil de usar.
SEC es un método que separa los componentes de un fluido en función del tamaño. Con esta técnica, se utiliza una columna de resina (ya sea hecha internamente o comprada comercialmente) para fraccionar una muestra. Las partículas pequeñas en la muestra quedan atrapadas entre las perlas dentro de la resina, mientras que las partículas más grandes pueden pasar a través de la resina más libremente y, por lo tanto, eluir antes en el proceso. Debido a que los EV son más grandes en tamaño que muchas proteínas extracelulares y agregados de proteínas, los EV pasan a través de la columna más rápido y eluyen en fracciones más tempranas que las proteínas extracelulares14.
En este documento de métodos, se describe el uso de SEC para la separación de EV de medios de cultivo celular (CCM) de oligodendrocitos humanos bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y control. Usando este protocolo, se muestra que los EV separados con esta técnica se encuentran dentro de fracciones específicas que pueden agruparse y concentrarse para la caracterización posterior, y que los EV separados se derivan de células y no de una fuente exógena como el suero bovino fetal (FBS) utilizado para complementar el CCM. La presencia de los marcadores canónicos de EV, CD63, CD81 y CD916,17,18,19 en las fracciones EV, y su ausencia en las fracciones proteicas se demuestra con western blotting. Usando microscopía electrónica de transmisión (TEM), los EV se visualizan y muestran la morfología esperada y solo se observan en la fracción EV. Las partículas también se cuentan en las fracciones EV y proteica de las condiciones de estrés de control y ER, y se observa un gran número de partículas dentro del rango de tamaño esperado de 50-200 nm de diámetro en las muestras EV. Juntos, estos datos apoyan la noción de que SEC es un método eficiente y efectivo para separar los EV de los medios de cultivo celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC es un método fácil de usar para separar adecuadamente los vehículos eléctricos de los CCM acondicionados. Para aislar específicamente las EV derivadas de células, se debe tener en cuenta cuidadosamente el tipo de MCP y sus suplementos. Muchos medios de cultivo celular deben complementarse con FBS, que contiene EV derivados del animal en el que se recolectó el suero. Estos EV séricos pueden saturar y enmascarar cualquier señal producida por EVs derivada de células en cultivo26. Por lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Penn State Behrend y a la Fundación de Salud Hamot por la financiación, así como a la Instalación de Microscopía de Penn State en University Park, PA.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
