Isolierung, Expansion und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem infrapatellaren Fettpolster des Ziegenwürgegelenks

Summary

Infrapatellare Fettpolster mesenchymale Stammzellen (IFP-MSCs) können leicht aus dem infrapatellaren Fettpolster des Kniegelenks isoliert werden. Sie vermehren sich gut in vitro, bilden CFU-F-Kolonien und differenzieren sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien. Hierin wird die Methodik für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenstielgelenk bereitgestellt.

Abstract

Das IFP, das im Kniegelenk vorhanden ist, dient als vielversprechende Quelle für MSCs. Das IFP ist ein leicht zugängliches Gewebe, da es routinemäßig bei arthroskopischen Eingriffen und Kniegelenkersatzoperationen reseziert und verworfen wird. Darüber hinaus ist seine Entfernung mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden. Neuere Studien haben gezeigt, dass IFP-MSCs während der In-vitro-Expansion ihre Proliferationsfähigkeit nicht verlieren und ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial aufweisen. IFP-MSCs besitzen ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipösen Stammzellen (ADSCs). Obwohl diese Zellen von älteren und kranken Patienten leicht zu erhalten sind, ist ihre Wirksamkeit begrenzt. Daher ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern wichtig, um ihre Wirksamkeit in biomedizinischen Anwendungen zu bestimmen. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender schwierig ist, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein, um ein grundlegendes Verständnis zu ermöglichen. Großtiere wie Hunde, Pferde, Schafe und Ziegen spielen in der translationalen Forschung eine entscheidende Rolle. Unter diesen könnte die Ziege ein bevorzugtes Modell sein, da das Würgegelenk der Ziege die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt. Darüber hinaus kann Ziegen-IFP die höheren MSC-Werte erfüllen, die für Geweberegenerationsanwendungen benötigt werden. Niedrige Kosten, Verfügbarkeit und die Einhaltung der 3R-Prinzipien für Tierversuche machen sie zudem zu einem attraktiven Modell. Diese Studie demonstriert ein einfaches Protokoll zur Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk von Ziegen und In-vitro-Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung. Das aseptisch isolierte IFP aus der Ziege wurde gewaschen, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Nach der Filtration und Zentrifugation wurden die gesammelten Zellen kultiviert. Diese Zellen waren adhärent, hatten eine MSCs-ähnliche Morphologie und zeigten bemerkenswerte klonogene Fähigkeiten. Darüber hinaus differenzierten sie sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien und demonstrierten ihre Multipotenz. Zusammenfassend zeigt die Studie die Isolierung und Ausbreitung von MSCs, die Potenzial für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin zeigen.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind ein attraktiver Kandidat für zellbasierte Therapien in der regenerativen Medizin ^1,2. Sie können aus einer Vielzahl von Gewebequellen wie Knochenmark, Nabelschnur, Plazenta, Zahnpulpa und subkutanem Fettgewebe gewonnen werden³. Da die Verfügbarkeit von Stammzellen bei Erwachsenen jedoch begrenzt ist und ihr Isolationsverfahren oft invasiv ist (was zu Morbidität an der Spenderstelle führt), ist es wünschenswert, eine alternative Stammzellquelle zu haben, die diese Herausforderungen umgehen könnte.

Das Kniegelenk ist ein Depot verschiedener Zelltypen, wie z.B. infrapatellare Fettpolster-abgeleitete MSCs, Synovialmembran-abgeleitete MSCs, Synovialflüssigkeits-abgeleitete MSCs, Ligament-Fibroblasten, artikuläre Chondrozyten usw. ^4,5,6. Diese Zellen haben das Potenzial, in der muskuloskelettalen Tissue Engineering-basierten Forschung umfassend erforscht zu werden. Daher könnte das Kniegelenk eine mögliche und zuverlässige Quelle für mehrere Arten von MSCs sein. Das im Kniegelenk befindliche Fettdepot, das als infrapatelläres Fettpolster (IFP) oder Hoffa-Fettpolster bekannt ist, ist eine vielversprechende und alternative Wahl des MSC-Depots. Das IFP ist eine relativ leicht zugängliche und klinisch erhältliche Quelle für MSCs, da es routinemäßig reseziert und als chirurgischer Abfall während einer Kniearthroskopie oder einer Operation am offenen Knie entsorgt wird. Die Entfernung des IFP ist mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden, was es auch zu einer attraktiven Gewebequelle macht. Obwohl sie ein ähnliches phänotypisches Profil aufweisen, haben MSCs aus IFP (IFP-MSCs) ein erhöhtes klonogenes Potenzial im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (BM-MSCs)⁶ und eine bessere Proliferationskapazität im Vergleich zu subkutanen Fettstammzellen (ADSCs)⁷. Interessanterweise verlieren IFP-MSCs im Vergleich zu Synovialflüssigkeits-abgeleiteten MSCs (SF-MSCs) weder ihre Proliferationskapazität bei späten Passagen, noch erhöht sich die Verdopplungszeit bei späten Passagen. Dies deutet darauf hin, dass IFP-MSCs während der Zellexpansion eine ausreichend große Anzahl von Zellen für In-vitro-Tissue-Engineering-Anwendungen erreichen können, ohne ihre Proliferationsrate zu beeinträchtigen⁸. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass IFP-MSCs ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipositas-abgeleiteten MSCs (ADSCs) besitzen, wahrscheinlich aufgrund ihrer anatomischen Nähe zum Gelenkknorpel, was auf ihre Eignung für das Knorpelgewebe-Engineering hinweist 6,7,9,10. Darüber hinaus besitzen sie auch ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial¹¹. Es wurde gezeigt, dass die intraartikuläre Injektion von IFP-MSCs bei Patienten mit Osteoarthritis (OA) Schmerzen lindert und die Kniegelenksfunktionen ^{verbessert12,13}. Darüber hinaus wurde auch über starke immunsuppressive Reaktionen und verbesserte immunmodulatorische Eigenschaften von IFP-MSCs in Gegenwart von inflammatorischen Zytokinen unter pathologischen Zuständen berichtet⁶.

IFP-MSCs sind eine vielversprechende und alternative Quelle für MSCs; Ihr therapeutischer Nutzen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin ist jedoch relativ wenig erforscht. Die bestehenden Studien zu IFP-MSCs haben hauptsächlich Zellen von menschlichen Spendern verwendet. Unter diesen haben einige neuere Studien IFP-MSCs von gesunden menschlichen Spendern (nicht-arthritische Patienten im Alter von 17-60 ^Jahren) untersucht6,14, während die meisten Studien IFP-MSCs von älteren Patienten verwendet haben^, die sich einer Kniegelenkersatzoperation unterzogen haben (erkrankte Patienten im Alter von 70-80 Jahren). Da bekannt ist, dass sowohl das Alter als auch die Krankheit die normale Funktion der Stammzellen verändern (reduzierte Anzahl und Verlust des funktionellen Potenzials), könnte dies möglicherweise zu Inkonsistenzen in den Ergebnissen der MSC-basierten Studien^führen 7,15,16,17. Darüber hinaus stellt die Verwendung von IFP-MSCs von Patienten mit pathophysiologischen Zuständen (z. B. Arthritis und Adipositas) auch Schwierigkeiten dar, die grundlegenden Eigenschaften gesunder Zellen in vitro zu verstehen, was als limitierender Faktor bei der Entwicklung von MSCs-basierten Therapien wirkt. Um diese Probleme zu überwinden, ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern von entscheidender Bedeutung. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender eine Herausforderung darstellt, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein. In diesem Zusammenhang gibt es einige Studien, in denen IFP aus Mäusen isoliert wurde¹⁸. Aufgrund der geringen Größe des Fettpolsters bei normalen Mäusen wurde jedoch Fettgewebe von mehreren Tieren kombiniert, um genügend Gewebe für die Durchführung aufwendiger experimenteller Verfahren zu erhalten¹⁹. Daher besteht ein Bedarf an einem großen Tiermodell, das die Anforderung an die höhere Anzahl von Zellen erfüllen und gleichzeitig die 3R-Prinzipien (verfeinern, ersetzen und reduzieren) im Tierversuch erfüllen^{könnte 20}. Die Verwendung von Großtieren hat erhebliche Auswirkungen auf die translationale Forschung. Insbesondere im Bereich des muskuloskelettalen Tissue Engineering wurde eine Reihe von Großtieren wie Hunden, Schweinen, Schafen, Ziegen und Pferden untersucht²¹. Die Ziege (Capra aegagrus hircus) ist eine ausgezeichnete Wahl für große Tiere, da ihr Würgegelenk die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt^22,23,24. Die subchondrale Knochentrabekelstruktur und die subchondrale Knochendicke von Ziegen ähneln denen des Menschen, und auch das Verhältnis von Knorpel zu Knochen wird dem des Menschen nahe gebracht²¹. Darüber hinaus wurden Ziegen auf der ganzen Welt domestiziert, so dass sie leicht verfügbar sind, wenn sie skelettreif sind. Darüber hinaus haben die geringen Wartungskosten und die einfache Handhabung sie zu einem attraktiven Tiermodell für die Forschung gemacht²².

In der vorliegenden Studie werden ein einfaches Protokoll für die Isolierung von IFP-MSCs aus dem Stifle-Gelenk von Capra aegagrus hircus (Ziege ) und in vitro Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung demonstriert. Die isolierten Zellen sind adhärent, haben eine MSC-ähnliche Morphologie, bilden CFU-F-Kolonien (koloniebildende Einheitsfibroblasten) und besitzen ein adipogenes, chondrogenes und osteogenes Differenzierungspotential. Daher zeigen IFP-MSCs Potenzial als alternative Quelle für MSCs für biomedizinische Anwendungen.

Protocol

Das Protokoll basiert auf der Isolierung von IFP-MSCs aus Ziegen. Ziegen-IFP und Blut wurden in einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Da solche Gewebeentnahmen nicht in den Zuständigkeitsbereich einer institutionellen Tierethikkommission fallen, war eine ethische Genehmigung nicht erforderlich. 1. Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk des Ziegenknies Sammeln Sie ein Femorotibialgelenk (Probe) der Ziege, das jeweils ~15 cm der Oberschenkel- und Tibiare…

Representative Results

Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk einer ZiegeDie Schritte bei der Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk einer Ziege sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Fettpolster, das in der inneren nicht artikulierten Oberfläche der Patella vorhanden war, wurde entfernt, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Die IFP-MSCs wurden erfolgreich isoliert und in vitro kultiviert (Abbildung 2A). <stron…

Discussion

Im vorliegenden Protokoll wurde eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung von MSCs aus Ziegen-IFP bereitgestellt. Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden in unseren früheren Studien erfolgreich zur In-vitro-Geweberegeneration eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass die isolierten Zellen proliferativ waren, auf verschiedene Wachstumsfaktoren ansprachen und ihre biologische Aktivität behielten, wenn sie auf elektrogesponnenen Fasern und Gerüsten ausgesät wurden<sup cl…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST