Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie
Summary
De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.
Abstract
Erfelijke immuniteit beschrijft hoe sommige dieren de “herinnering” aan een eerdere infectie kunnen doorgeven aan hun nakomelingen. Dit kan de resistentie tegen ziekteverwekkers in hun nageslacht verhogen en de overleving bevorderen. Hoewel erfelijke immuniteit is gemeld bij veel ongewervelde dieren, zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan dit epigenetische fenomeen grotendeels onbekend. De infectie van Caenorhabditis elegans door de natuurlijke microsporidische ziekteverwekker Nematocida parisii resulteert in de wormen die nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen microsporidia. Het huidige protocol beschrijft de studie van intergenerationele immuniteit in het eenvoudige en genetisch verhandelbare N. parisii –C. elegans infectiemodel. Het huidige artikel beschrijft methoden voor het infecteren van C. elegans en het genereren van immuungeprimeerde nakomelingen. Er worden ook methoden gegeven voor het testen van de weerstand tegen microsporidia-infectie door kleuring voor microsporidia en het visualiseren van infectie door microscopie. In het bijzonder voorkomt erfelijke immuniteit gastheercelinvasie door microsporidia en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kan worden gebruikt om invasiegebeurtenissen te kwantificeren. De relatieve hoeveelheid microsporidia-sporen die in de immuungeprimeerde nakomelingen worden geproduceerd, kan worden gekwantificeerd door de sporen te kleuren met een chitinebindende kleurstof. Tot op heden hebben deze methoden licht geworpen op de kinetische en pathogene specificiteit van erfelijke immuniteit, evenals de moleculaire mechanismen die eraan ten grondslag liggen. Deze technieken, samen met de uitgebreide hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor C. elegans-onderzoek , zullen belangrijke ontdekkingen op het gebied van erfelijke immuniteit mogelijk maken.
Introduction
Erfelijke immuniteit is een epigenetisch fenomeen waarbij ouderlijke blootstelling aan pathogenen de productie van infectieresistente nakomelingen mogelijk kan maken. Dit type immuungeheugen is aangetoond bij veel ongewervelde dieren die geen adaptief immuunsysteem hebben en kunnen beschermen tegen virale, bacteriële en schimmelziekten1. Hoewel erfelijke immuniteit belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van zowel gezondheid als evolutie, zijn de moleculaire mechanismen die aan deze bescherming ten grondslag liggen grotendeels onbekend. Dit komt deels omdat veel van de dieren waarbij erfelijke immuniteit is beschreven, geen gevestigde modelorganismen zijn voor onderzoek. Daarentegen profiteren studies in de transparante nematode Caenorhabditis elegans van een uitgebreide genetische en biochemische toolkit 2,3, een sterk geannoteerd genoom 4,5 en een korte generatietijd. Inderdaad, onderzoek in C. elegans heeft fundamentele vooruitgang mogelijk gemaakt op het gebied van epigenetica en aangeboren immuniteit 6,7, en het is nu een gevestigd model voor het bestuderen van immuungeheugen 8,9.
Microsporidia zijn schimmelpathogenen die bijna alle dieren infecteren en dodelijke infecties veroorzaken bij immuungecompromitteerde mensen10. Infectie begint wanneer een microsporidia-spore zijn cellulaire inhoud (sporoplasma) injecteert of “afvuurt” in een gastheercel met behulp van een structuur die een polaire buis wordt genoemd. Intracellulaire replicatie van de parasiet resulteert in de vorming van meronten, die uiteindelijk differentiëren in volwassen sporen die de cel kunnen verlaten11,12. Hoewel deze parasieten schadelijk zijn voor zowel de menselijke gezondheid als de voedselzekerheid, is er nog veel te leren over hun infectiebiologie12. Nematocida parisii is een natuurlijke microsporidische parasiet die zich uitsluitend in de darmcellen van wormen vermenigvuldigt, wat resulteert in verminderde vruchtbaarheid en uiteindelijk de dood. Het N. parisii –C. elegans infectiemodel is gebruikt om aan te tonen: (1) de rol van autofagie bij de klaring van pathogenen13, (2) hoe microsporidia geïnfecteerde cellen niet-lytisch kunnen verlaten14, (3) hoe pathogenen zich van cel tot cel kunnen verspreiden door syncytia15 te vormen, (4) de eiwitten die N. parisii gebruikt om te communiceren met zijn gastheer16, en (5) de regulatie van de transcriptionele intracellulaire pathogene respons (IPR)17, 18.
Protocollen voor de infectie van C. elegans worden beschreven in het huidige werk en kunnen worden gebruikt om de unieke microsporidia-biologie te onthullen en de reactie van de gastheer op infectie te ontleden. De microscopie van vaste wormen gekleurd met de chitinebindende kleurstof Direct Yellow 96 (DY96) toont de infectieverspreiding van chitinebevattende microsporidia-sporen door de darm. DY96-kleuring maakt ook de visualisatie van chitinebevattende wormembryo’s mogelijk voor de gelijktijdige beoordeling van worm graviditeit (vermogen om embryo’s te produceren) als een uitlezing van de geschiktheid van de gastheer.
Recent werk heeft aangetoond dat C. elegans geïnfecteerd met N. parisii nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen dezelfde infectie19. Deze erfelijke immuniteit duurt een enkele generatie en is dosisafhankelijk, omdat nakomelingen van zwaarder geïnfecteerde ouders resistenter zijn tegen microsporidia. Interessant is dat N. parisii-geprimeerde nakomelingen ook resistenter zijn tegen de bacteriële darmpathogeen Pseudomonas aeruginosa, hoewel ze niet beschermd zijn tegen de natuurlijke ziekteverwekker Orsay-virus19. Het huidige werk toont ook aan dat immuungeprimeerde nakomelingen de invasie van gastheercellen door microsporidia beperken. De methode beschrijft ook de verzameling immuungeprimeerde nakomelingen en hoe FISH kan worden gebruikt om N. parisii-RNA in darmcellen te detecteren om gastheercelinvasie en sporenvurente testen 20.
Samen bieden deze protocollen een solide basis voor het bestuderen van microsporidia en erfelijke immuniteit in C. elegans. Het is te hopen dat toekomstig werk in dit modelsysteem belangrijke ontdekkingen op het ontluikende gebied van erfelijke immuniteit mogelijk zal maken. Deze technieken zijn waarschijnlijk ook startpunten voor het onderzoeken van microsporidia-geïnduceerde erfelijke immuniteit in andere gastheerorganismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de studie van microsporidia en erfelijke immuniteit in een eenvoudig en genetisch handelbaar N. parisii –C. elegans infectiemodel.
Sporenpreparaat is een intensief protocol dat doorgaans voldoende sporen oplevert voor 6 maanden experimenten, afhankelijk van de productiviteit24. Belangrijk is dat de infectiviteit moet worden bepaald voor elke nieuwe sporen “partij” voordat het voor de experimenten wordt gebruikt. Vanwege …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Winnie Zhao en Yin Chen Wan dankbaar voor het geven van nuttig commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
