הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q
Summary
שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.
Abstract
נקבובית מעבר החדירות המיטוכונדרית (mPTP) היא ממברנה מיטוכונדריאלית פנימית מגודרת מתח, לא סלקטיבית ופנימית (IMM) בעלת תעלת ענק החשובה בבריאות ובמחלות. ה-mPTP מתווך דליפה של פרוטונים על פני ה-IMM במהלך פתיחת מוליכות נמוכה, והוא מעוכב באופן ספציפי על-ידי ציקלוספורין A (CsA). קו-אנזים Q (CoQ) הוא מווסת של ה-mPTP, והבדלים ספציפיים לרקמות נמצאו בתוכן ה-CoQ ובהסתברות הפתוחה של ה-mPTP במיטוכונדריה של המוח הקדמי והלב במודל עכבר שזה עתה נולד של תסמונת X שברירית (FXS, Fmr1 knockout). פיתחנו טכניקה לקביעת סף המתח של פתיחת mPTP בזן מוטנטי זה, תוך ניצול תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים.
לשם כך, צריכת החמצן ופוטנציאל הממברנה (ΔΨ) נמדדו בו זמנית במיטוכונדריה מבודדת באמצעות פולרוגרפיה ואלקטרודה סלקטיבית יונים של טטרפניל פוספוניום (TPP+) במהלך נשימת דליפה. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP הוגדרו במדויק בהקשר של עודף CoQ. טכניקה חדשנית זו תאפשר חקירה עתידית לשיפור ההבנה של רגולציה פיזיולוגית ופתולוגית של פתיחת מוליכות נמוכה של mPTP.
Introduction
ה-mPTP מתווך את מעבר החדירות (PT), לפיו ה-IMM הופך להיות חדיר בפתאומיות למולקולות קטנות ומומס 1,2. תופעה בולטת זו היא סטייה מובהקת מהאטימות האופיינית של ה-IMM, שהיא בסיסית לביסוס השיפוע האלקטרוכימי הנחוץ לזרחון חמצוני3. PT, בניגוד למנגנוני הובלה מיטוכונדריאליים אחרים, הוא תהליך בעל מוליכות גבוהה, לא ספציפי ולא סלקטיבי, המאפשר מעבר של טווח מולקולות עד 1.5 kDa 4,5. ה-mPTP הוא ערוץ מגודר מתח בתוך ה-IMM שפתיחתו משנה את ΔΨ, ייצור ATP, הומאוסטזיס של סידן, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וכדאיות תאים4.
בקיצוניות הפתולוגית, פתיחה בלתי מבוקרת וממושכת של מוליכות גבוהה של mPTP מובילה לקריסת השיפוע האלקטרוכימי, התנפחות מטריצה, דלדול של נוקלאוטידים של מטריצה פירידין, קרע בממברנה החיצונית, שחרור חלבונים אינטר-ממברניים (כולל ציטוכרום c), ובסופו של דבר, מוות תאי 4,6. פתיחת mPTP פתולוגית כזו הייתה מעורבת בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה לבבית, אי ספיקת לב, פגיעה מוחית טראומטית, מחלות נוירודגנרטיביות שונות וסוכרת 1,7. עם זאת, פתיחת mPTP בהולכה נמוכה היא פיזיולוגית באופיה, ובניגוד לפתיחה בהולכה גבוהה, אינה מובילה לדה-פולריזציה עמוקה או לנפיחות מיטוכונדריאלית4.
פתיחה עם מוליכות נמוכה של הנקבובית מגבילה את החדירות לכ-300 Da, מאפשרת מעבר של פרוטונים ללא תלות בסינתזת ATP, ומהווה מקור פוטנציאלי לדליפת פרוטונים פיזיולוגית5. פתיחת mPTP פיזיולוגית גורמת לירידה מבוקרת ב-ΔΨ, מגבירה את שטף האלקטרונים דרך שרשרת ההובלה הנשימתית, וגורמת לפרץ קצר או הבזק של סופראוקסיד, מה שתורם לאותת ROS8. ויסות של פתיחת mPTP חולפת כזו חשוב להומאוסטזיס של סידן ולהתפתחות תקינה של התאיםולהבשלתם 4,9,10,11. פתיחת נקבוביות חולפת בתאי עצב מתפתחים, למשל, מעוררת התמיינות, בעוד שסגירת ה-mPTP גורמת להבשלה אצל קרדיומיוציטים לא בשלים 4,5.
למרות שהמשמעות התפקודית של ה-mPTP בבריאות ובמחלות מבוססת היטב, הזהות המולקולרית המדויקת שלו עדיין נתונה לוויכוח. ההתקדמות במבנה המולקולרי ובתפקוד של ה-mPTP נבדקה באופן מקיף במקום אחר12. בקצרה, נכון לעכשיו, ההשערה היא שמצבי מוליכות גבוהים ונמוכים של ה-mPTP מתווכים על ידי ישויות מובחנות12. המועמדים המובילים הם F1/F0 ATP סינתאז (ATP synthase) וטרנספורטר נוקלאוטידים אדנין (ANT) למצבי מוליכות גבוהה ונמוכה, בהתאמה12.
למרות חוסר ההסכמה לגבי הזהות המדויקת של המרכיב יוצר הנקבוביות של ה-mPTP, מפורטים מאפיינים מרכזיים מסוימים. תכונה מבוססת היטב של mPTP היא שהוא מווסת על ידי השיפוע האלקטרוכימי כך שדה-פולריזציה של ה- IMM מובילה לפתיחת נקבוביות13. עבודות קודמות הראו כי מצב החמצן מחדש של קבוצות תיול ויצינליות משנה את טמפרטורת המתח של ה-mPTP, כך שחמצון פותח את הנקבובית ב-ΔΨs גבוהים יחסית, והפחתת קבוצת תיול גורמת להסתברות mPTP סגורה14. עם זאת, זהותו של חיישן המתח החלבון אינה ידועה.
זוהו מולקולות קטנות שונות המווסתות את ההסתברות הפתוחה של הנקבובית. לדוגמה, ניתן לעורר את ה-mPTP להיפתח עם סידן, פוספט אנאורגני, חומצות שומן ו-ROS, והוא יכול להיות מעוכב על ידי נוקלאוטידים אדנין (במיוחד ADP), מגנזיום, פרוטונים ו-CsA 5,12. מנגנוני הפעולה של חלק מהרגולטורים הללו הובהרו. סידן מיטוכונדריאלי מפעיל את פתיחת ה-mPTP לפחות בחלקה על ידי קשירת תת-היחידה β של ה-ATP synthase15. ROS יכול להפעיל את ה-mPTP על ידי הפחתת הזיקה שלו ל-ADP והגברת הזיקה שלו לציקלופילין D (CypD), מפעיל ה-mPTP החלבון הנחקר ביותר16. מנגנון ההפעלה של mPTP על ידי פוספט אנאורגני וחומצות שומן הוא פחות ברור. באשר למעכבים אנדוגניים, ADP נחשב כמעכב את ה-mPTP על ידי קשירת ANT או ATP synthase, בעוד שמגנזיום מפעיל את השפעתו המעכבת על ידי הרחקת סידן מאתר הקישור שלו 15,17,18,19.
pH נמוך מעכב את פתיחת ה-mPTP על-ידי פרוטונציה של היסטידין 112 של תת-היחידה הרגולטורית של תת-היחידה המעניקה רגישות לאוליגומיצין (OSCP) של ה-ATP synthase 12,20,21. המעכב הפרמקולוגי האבטיפוסי של mPTP, CsA, פועל על ידי קשירת CypD ומניעת הקשר שלו עם OSCP22,23. עבודות קודמות הראו גם כי מגוון אנלוגים של CoQ מתקשרים עם mPTP, מעכבים אותו או מפעילים אותו24. בעבודה האחרונה מצאנו עדויות ל-mPTP פתוח פתולוגית, דליפת פרוטונים מוגזמת וזרחון חמצוני לא יעיל עקב מחסור ב-CoQ במיטוכונדריה קדמית של גורי עכברי FXS שזה עתה נולדו25.
סגירת הנקבובית עם CoQ אקסוגני חסמה את דליפת הפרוטונים הפתולוגיים וגרמה לבגרות מורפולוגית של עמודי שדרה דנדריטיים25. באופן מעניין, באותם בעלי חיים, קרדיומיוציטים של FXS היו בעלי רמות CoQ מוגזמות והסתברות mPTP סגורה בהשוואה לבקרות wildtype26. אף על פי שהסיבה להבדלים ספציפיים לרקמות אלה ברמות ה-CoQ אינה ידועה, הממצאים מדגישים את הרעיון ש-CoQ אנדוגני הוא ככל הנראה הרגולטור המרכזי של ה-mPTP. עם זאת, יש פער גדול בידע שלנו מכיוון שהמנגנון של עיכוב בתיווך CoQ של ה-mPTP עדיין אינו ידוע.
ויסות ה-mPTP הוא גורם מכריע באיתות התאובהישרדותו 4. לפיכך, גילוי פתיחת mPTP בתוך המיטוכונדריה הוא המפתח כאשר בוחנים מנגנונים פתופיזיולוגיים ספציפיים. בדרך כלל, הסף לפתיחת נקבוביות בעל מוליכות גבוהה נקבע באמצעות סידן כדי להפעיל את מעבר החדירות. העמסת סידן כזו מובילה לקריסת פוטנציאל הממברנה, לניתוק מהיר של זרחון חמצוני ולנפיחות מיטוכונדריאלית27,28. ביקשנו לפתח שיטה לאיתור פתיחת mPTP עם מוליכות נמוכה באתרה, מבלי לגרום לה כשלעצמה.
הגישה מנצלת את תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים. לשם כך, נעשה שימוש באלקטרודות סלקטיביות מסוג קלארק ו-TPP+ כדי למדוד בו-זמנית את צריכת החמצן ואת פוטנציאל הממברנה, בהתאמה, במיטוכונדריה מבודדת במהלך נשימת דליפה29. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של mPTP בהקשר של עודף CoQ הוגדרו במדויק.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה להערכת ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP. באופן ספציפי, סף המתח לפתיחת mPTP בהולכה נמוכה נקבע על ידי הערכת ההשפעה של עיכוב CsA על דליפת פרוטונים בטווח של ΔΨs. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לזהות הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP בין עכברי FXS לבקרות FVB התואמים את ההבדלים ביניהם בתכולת ה-CoQ הספציפית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), פרס המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה אירווינג יעד ההזדמנות למחלקה להרדמה (K.K.G.), פרס מחקר החוקר הצעיר של האגודה להרדמה בילדים (K.K.G.), ו- NIH/NINDS R01NS1112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
References
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. 发育生物学. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
