Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine
Summary
Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l’analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.
Abstract
La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l’eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L’imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all’imaging. L’ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L’attuale protocollo fornisce il codice per l’analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all’interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.
Introduction
La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi 1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell’eterogeneità della fosforilazione del recettore, sia in abbondanza che nei modelli specifici di fosfotirosina che possono fornire un mezzo per manipolare le uscite di segnalazione dettando la composizione del signalosoma 3,4,5,6,7. Tuttavia, ci sono limitazioni nei metodi attuali per interrogare la fosforilazione delle proteine. L’analisi Western blot è eccellente per descrivere le tendenze della fosforilazione delle proteine, ma è semi-quantitativa8 e non fornisce informazioni sull’eterogeneità del sistema perché migliaia o milioni di recettori sono mediati insieme. Mentre i western blot consentono di sondare un campione utilizzando anticorpi fosfo-specifici contro tirosine specifiche, non possono fornire informazioni sui modelli di fosforilazione multisito all’interno della stessa proteina. La fosfoproteomica quantitativa riporta l’abbondanza di fosfotirosina, ma ci sono limitazioni al rilevamento della fosforilazione multisito, poiché i residui di interesse devono essere localizzati all’interno dello stesso peptide (tipicamente 7-35 amminoacidi) generato dalla digestione enzimatica 9,10,11.
Per superare i limiti sopra menzionati, il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato adattato per quantificare gli stati di fosforilazione dei recettori intatti a livello di singola molecola. SiMPull è stato dimostrato per la prima volta come un potente strumento per interrogare complessi macromolecolari da Jain et al.12,13. In SiMPull, i complessi macromolecolari sono stati immunoprecipitati (IP) su coverslip di vetro funzionalizzati con anticorpi e quindi analizzati attraverso la microscopia a singola molecola per il numero di subunità proteiche e co-IP con componenti complessi12. Una modifica di Kim et al.14, chiamata SiMBlot, è stata la prima a utilizzare una variazione di SiMPull per analizzare la fosforilazione delle proteine denaturate. Il protocollo SiMBlot si basa sulla cattura di proteine di superficie cellulari biotinilate utilizzando coverslip rivestiti con NeutrAvidin, che vengono quindi sondati per la fosforilazione con l’etichettatura degli anticorpi fosfo-specifici14. Nonostante questi progressi, erano necessari miglioramenti per rendere la quantificazione della modificazione post-traduzionale più robusta e applicabile a una gamma più ampia di proteine.
Il presente protocollo descrive un approccio SiMPull ottimizzato che è stato utilizzato per quantificare i modelli di fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico intatto (EGFR) in risposta a una serie di condizioni del ligando e mutazioni oncogeniche15. Mentre questo lavoro si concentra sull’EGFR, questo approccio può essere applicato a qualsiasi recettore di membrana e proteine citosoliche di interesse (POI), per le quali sono disponibili anticorpi di qualità. Il protocollo include passaggi per ridurre l’autofluorescenza del campione, un design dell’array di campioni che richiede un volume minimo del campione con preparazione simultanea fino a 20 campioni e l’ottimizzazione delle condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi. Sono stati sviluppati algoritmi di analisi dei dati per il rilevamento e la quantificazione di proteine fosforilate a singola molecola.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l’affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell’autofluorescenza con il trattamento con NaBH4 e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L’utilizzo della maschera …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 to DSL. EMB è stato supportato attraverso il programma ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e JAR dal programma UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Riconosciamo con gratitudine l’utilizzo della risorsa condivisa di microscopia a fluorescenza del Comprehensive Cancer Center dell’Università del New Mexico, supportata da NIH P30CA118100. Vogliamo ringraziare i dottori Ankur Jain e Taekijip Ha, il cui sviluppo originale di SiMPull ha ispirato questo lavoro.
Indirizzo attuale di ES-C: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
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