Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN
Summary
Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.
Abstract
Les microARN (miARN) sont apparus comme d’importants régulateurs cellulaires (suppresseurs de tumeurs, facteurs pro-oncogènes) du cancer et des métastases. La plupart des études publiées se concentrent sur un seul miARN lors de la caractérisation du rôle des petits ARN dans le cancer. Cependant, environ 30% des gènes de miARN humains sont organisés en unités groupées qui sont souvent co-exprimées, indiquant un système complexe et coordonné de régulation de l’ARN non codant. Une sous-estimation plus claire de la façon dont les réseaux de miARN groupés fonctionnent de manière coopérative pour réguler la croissance tumorale, l’agressivité du cancer et la résistance aux médicaments est nécessaire avant de traduire les petits ARN non codants à la clinique.
L’utilisation d’une procédure d’édition de gènes à répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées à haut débit (CRISPR) a été utilisée pour étudier le rôle oncogène d’un groupe génomique de sept gènes miARN situés dans un locus d’une longueur d’environ 35 000 pb dans le contexte du cancer de la prostate. Pour cette approche, des lignées cellulaires cancéreuses humaines ont été infectées par un vecteur de lentivirus pour la nucléase Cas9 inductible à la doxycycline (DOX) cultivée dans un milieu contenant du DOX pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été co-transfectées avec de l’ARN CRISPR transactivant synthétique (tracrRNA) complexé avec des oligonucléotides d’ARN CRISPR (crRNA) spécifiques au site génomique pour permettre la génération rapide de lignées cellulaires cancéreuses porteuses de la délétion de l’ensemble du groupe de miARN et des délétions de groupes de gènes de miARN individuels ou combinés au sein d’une seule expérience.
Les avantages de ce système d’édition de gènes à haut débit sont la possibilité d’éviter le sous-clonage de vecteurs d’ADN fastidieux, la flexibilité de transfecter des cellules avec des combinaisons d’ARN guides uniques dans un format de 24 puits, et le génotypage PCR à moindre coût à l’aide de lysats cellulaires bruts. Les études utilisant cette approche simplifiée promettent de découvrir des redondances fonctionnelles et des interactions synergiques / antagonistes entre les membres du cluster de miARN, ce qui aidera à caractériser les petits réseaux d’ARN complexes non codants impliqués dans les maladies humaines et à mieux éclairer la conception thérapeutique future.
Introduction
De meilleurs outils de recherche sont nécessaires pour étudier la contribution des ARN non codants dans les maladies humaines. La dérégulation des MiARN est souvent observée dans les troubles humains tels que le cancer lorsque l’on compare les profils d’expression de ces petits ARN non codants dans les tissus et les fluides corporels (par exemple, le sang, l’urine) des patients cancéreux par rapport aux personnes non cancéreuses en bonne santé, en utilisant des microréseaux, une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et des technologies de séquençage profond de nouvelle génération 1,2 . Des travaux récents ont caractérisé un grand sous-ensemble de ces miARN comme suppresseurs de tumeurs, oncogènes et métastases qui contrôlent la formation tumorale, la progression de la maladie et la résistance aux médicaments. La surexpression expérimentale et/ou la régulation négative/perte de miARN entraînent des conséquences fonctionnelles et pléiotropes dans la cellule, reflétant le large éventail d’activités associées au cancer que ces ARN non codants coordonnent – croissance, apoptose, différenciation, remodelage de la chromatine, angiogenèse, transitions épithéliale à mésenchymateuse (EMT) et MET, métabolisme et réponse immunitaire3.
Les miARN sont codés en tant que gènes uniques ou résident dans des grappes génomiques, qui sont transcrits dans le noyau et largement traités avant de générer les espèces de miARN monocaténaires (nt) biologiquement matures et monocaténaires (nt) localisées dans le cytoplasme4. Ces petits ARN exercent leurs effets post-transcriptionnellement et agissent comme des régulateurs de gènes négatifs qui se lient aux cibles d’ARN messager (ARNm) d’une manière spécifique à la séquence pour amener le complexe de silençage induit par l’ARN catalytique (RISC) au site de l’ARNm, entraînant une dégradation de l’ARNm et/ou un blocage de la traduction des protéines. Les miARN sont une classe extrêmement abondante d’ARN non codants dans les systèmes animaux, et 2 654 miARN matures existent dans le génome humain (miRBase release 22.1)5. Les MiARN s’associent généralement à une complémentarité incomplète avec leurs cibles d’ARNm4. Par conséquent, un seul miARN peut réguler des dizaines à des centaines de cibles d’ARNm distinctes et avoir un impact fonctionnel sur un large éventail de voies biologiques. Pour ajouter à la complexité des mécanismes basés sur les miARN, un seul ARNm peut être régulé par plusieurs miARN distincts. Il est donc difficile d’étudier comment la dérégulation du miARN perturbe l’équilibre homéostatique du corps et conduit à la malignité humaine.
La majorité des études publiées se sont concentrées sur un seul miARN lors de la caractérisation de leur rôle dans les événements pathologiques. Cependant, environ 30% des gènes de miARN humains sont organisés en unités groupées (généralement ~ 10 kilobases [kb]) qui sont souvent transcrites dans la même orientation et co-exprimées, indiquant un système coordonné et complexe de régulation de l’ARN non codant6. Le plus grand cluster de miARN humains polycistroniques est le cluster 14q32 comprenant 54 précurseurs de miARN. L’une des unités de miARN groupées les mieux étudiées associées aux cancers humains est le groupe polycistronique miR-17-92 composé de miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 et miR-92-1 résidant dans l’intron 3 de l’ARN non codant, c13orf25. Le groupe miR-17-92 est fréquemment amplifié dans les tumeurs malignes hématopoïétiques et surexprimé dans les tumeurs solides et a établi des rôles oncogènes dans la promotion de la progression du cycle cellulaire, de l’apoptose et de l’angiogenèse7. En outre, le groupe suppresseur de tumeur miR-15a et miR-16-1 situé dans l’intron du gène non codant Leu2 est souvent supprimé dans les leucémies et régulé à la baisse dans une large gamme de cancers, fonctionnant pour bloquer la croissance tumorale en ciblant le gène antiapoptotique BCL2 et d’autres gènes de progression du cycle cellulaire8. Le groupe miR-888 est élevé chez les patients atteints d’un cancer de la prostate de haut grade et se compose de sept gènes miARN (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b et -891a) situés sur le chromosome humain Xq27.3 9,10.
Les cartes de grappe miR-888 dans le locus HPCX1 (cancer héréditaire de la prostate, lié à l’X 1) couvrant Xq27-2, qui ont été identifiées par une analyse de couplage des pedigrees de la famille du cancer de la prostate héréditaire 11,12,13,14,15,29. La caractérisation fonctionnelle des membres individuels en grappes de miR-888 à l’aide d’outils conventionnels de mauvaise expression des miARN – mimiques de miARN et inhibiteurs antisens – a indiqué que ces miARN jouent des rôles qui se chevauchent dans la régulation de la croissance et de l’invasion tumorales de la prostate 9,10. Cependant, ces méthodes expérimentales ne se prêtent pas facilement à l’étude de la façon dont plusieurs membres groupés miR-888 agissent en synergie ou de manière antagoniste dans un réseau d’ARN non codant pour contrôler l’homéostasie tissulaire et la progression du cancer. Ce protocole simplifié décrit utilisant la technologie d’édition de gènes CRISPR à haut débit est modifié pour disséquer moléculairement les grappes de miARN associées aux cancers humains (par exemple, la grappe miR-888) afin de combler cette lacune dans les connaissances.
Les gènes bactériens CRISPR et associés à CRISPR (cas) médient l’immunité adaptative contre les bactériophages16. La découverte de cet ancien système de surveillance procaryote a été rapidement adaptée en tant qu’outil scientifique efficace pour cibler facilement tout locus génomique souhaité et effectuer des altérations de séquence d’ADN dans un large éventail de systèmes animaux et de types de cellules in vitro et in vivo16,17. Cette technique est très prometteuse en tant que méthode efficace pour interroger les réseaux de miARN dans le contexte de la maladie humaine. À cette fin, ce protocole d’édition de gènes CRISPR à haut débit pour étudier le cluster miR-888 couvrant environ 35 kb sur le chromosome X humain dans des lignées cellulaires de cancer de la prostate humaine immortalisées (LNCaP, PC3-ML) est construit pour interroger la façon dont les membres du cluster coordonnent les voies de progression du cancer. Cette approche peut être appliquée à la caractérisation de n’importe quel groupe de miARN et permet aux chercheurs de générer rapidement des lignées cellulaires humaines porteuses de la délétion de l’ensemble du groupe de miARN et des délétions individuelles et combinées de grappes de gènes de miARN dans une seule expérience.
Dans cette procédure, des lignées cellulaires stables sont établies portant un système d’expression lentiviral inductible à la doxycycline (DOX) qui permet à l’investigateur de contrôler l’expression du gène de l’endonucléase Cas9 (csn1) associée à Streptococcus pyogenes CRISPR via le promoteur constitutif INDUCTIBLE DOX TRE3G. Le système bipartite Tet-On 3G implique un promoteur constitutif du facteur d’élongation humain 1 alpha (hEF1alpha) pour conduire la transcription du gène Tet-On 3G et du gène de résistance à la blasticidine (BlastR) sous forme de transcription bicistronique. La protéine transactivatrice Tet-On 3G ne se lie au promoteur TRE3G qu’en présence de DOX, ce qui entraîne une transcription Cas9 robuste. En l’absence de DOX, il n’y a pas ou très peu d’expression basale de Cas9. Par conséquent, l’investigateur peut induire une production élevée de protéine Cas9 dans les cellules cultivées dans des milieux supplémentés en DOX pendant les étapes d’édition du gène CRISPR et le contrôle pour une clairance rapide de la protéine CAS9 lors du retrait doX.
Ce protocole décrit également la conception d’oligonucléotides synthétiques d’ARN CRISPR (ARNc) ciblant les régions flanquant l’ensemble du groupe de miARN, les régions individuelles en épingle à cheveux des miARN (prémiARN) et/ou des sous-ensembles de gènes de miARN au sein du cluster. Chaque ARNc conçu contient une séquence guide unique de 5′-terminal 20 nt (complémentaire à la séquence génomique d’intérêt à cibler), suivie d’une séquence de répétition invariante de 22 nt de S. pyogenes (5′-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3′) qui permet l’appariement de bases avec les oligonucléotides universels transactivateurs de l’ARN CRISPR (tracrRNA)18. Ensemble, l’ARNc recuit et l’ARNr (rapport mixte 1:1) servent d’ARN guide pour ce protocole (Figure 1A). Dans chaque expérience, deux ARN guides synthétiques sont transfectés en cellules induites par DOX pour associer et escorter la protéine Cas9 bactérienne vers les sites d’ADN génomique (5′ et 3′) flanquant la région du cluster de miARN ciblée pour élimination (Figure 1B).
Une séquence de motif adjacent (PAM) de protospacer (5′-NGG-3′ pour le type sauvage S. pyogenes Cas9) doit être présente dans le génome cellulaire et située immédiatement à côté de la séquence d’ADN 20 nt ciblée par l’ARN guide17. La séquence PAM sert de signal de liaison et positionne la région catalytique de l’enzyme Cas9 de l’endonucléase sur le site d’ADN génomique ciblé, conduisant par la suite à un clivage dirigé de l’ADN double brin (ds) situé à environ 3 nt en amont du PAM. La machinerie de réparation de l’ADN de la cellule répare les extrémités de l’ADN clivées, ce qui peut entraîner une ligature parfaite, mais souvent une jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) se produit, provoquant de petites insertions ou délétions (indels) sur le site de réparation. Étant donné que les miARN sont des gènes non codants souvent situés dans des régions intergéniques et introniques, ces indels présentent un faible risque de créer des mutations indésirables absurdes / faux-sens.
En utilisant des oligonucléotides d’ARN synthétiques (ARNc recuit et tracrRNA, rapport molaire 1:1) codant pour le complexe d’ARN guide dans ces expériences, cette stratégie d’élimination génique évite le sous-clonage de vecteurs d’ADN fastidieux et permet une grande flexibilité dans la transfectation de combinaisons d’ARN guides uniques aux cellules dans un format de 24 puits. La préparation de lysats cellulaires bruts pour le dépistage du génotype par PCR évite également les méthodes de purification de l’ADN coûteuses et longues, tout en permettant une génération rationalisée de lignées cellulaires à colonie unique et une analyse phénotypique. En effet, ce protocole d’édition de gènes CRISPR à haut débit a été utilisé avec succès pour transfecter des lignées cellulaires de cancer de la prostate en culture (LNCaP, PC3-ML) avec 32 combinaisons d’ARN guides uniques en une seule expérience et générer des lignées knockout portant des délétions pour toute la région du cluster miR-888 d’environ 35 kb; des combinaisons de délétion plus petites pour les membres du cluster miR-888 appartenant aux familles miR-743 et miR-891a; ainsi que des suppressions pour les membres individuels des miARN au sein du cluster miR-888. Des études comme celles-ci fourniront une sous-estimation plus claire de la façon dont les miARN groupés fonctionnent de manière coopérative pour réguler la croissance tumorale, l’agressivité et la résistance aux médicaments avant de traduire les miARN à la clinique en tant qu’outils thérapeutiques et diagnostiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure d’édition de gènes CRISPR permet à l’investigateur de générer rapidement un panel entier de lignées cellulaires portant des combinaisons uniques de délétion de grappes de miARN. La transfection d’ARN guides synthétiques composés d’ARNnc génomiques spécifiques à un site de 5′ et 3′ recuits avec de l’ARNr synthétique (rapport molaire 1:1) dans ce protocole évite le sous-clonage vectoriel plasmidique fastidieux et permet une conception expérimentale plus flexible et à haut débit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les lignées cellulaires PC3-ML ont été aimablement fournies par Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey a aidé au génotypage par PCR. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Breedan Adams, un Fonds de recherche translationnelle Ryan et une subvention du Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) à AE-K.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
References
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