색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화
Summary
여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.
Abstract
박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 매우 중요합니다. 박테리아 운동성은 많은 병원성 종의 침입 및/또는 보급에 매우 중요합니다. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 산소, pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 성장과 박테리아 편모의 발현에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 운동성을 감소시키거나 심지어 운동성을 상실하여 박테리아 운동성에 대한 부정확한 평가를 초래할 수 있습니다. 살아있는 박테리아의 세포 내 탈수소효소에 의한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 검출을 위해 전통적인 반고체 한천에 TTC를 첨가했습니다. 그 결과 박테리아 운동성 검출을 위한 이 TTC 반고체 한천 방법이 간단하고 작동하기 쉬우며 크고 값비싼 기구가 필요하지 않다는 것을 보여주었습니다. 그 결과, 0.3% 한천으로 제조된 반고체 배지에서 가장 높은 운동성이 관찰되는 것으로 나타났다. 기존의 반고체 매체와 비교하여 결과를 평가하기 쉽고 정확합니다.
Introduction
박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 중요한 역할을 합니다1. 박테리아 운동성은 병원성과 밀접한 관련이 있으며, 숙주 세포의 초기 감염 동안 박테리아 집락화에 필요하다2. 생물막 형성은 박테리아 운동성과 밀접한 관련이 있으며, 박테리아는 운동성을 통해 고체 배지의 표면에 부착됩니다. 박테리아의 운동성은 오랫동안 생물막 형성과 양의 상관관계가 있는 것으로 여겨져 왔습니다. 생물막으로 인한 높은 수준의 박테리아 약물 내성은 인체 건강에 위협이되는 지속적인 감염을 유발할 수 있습니다 3,4,5. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 박테리아 운동성 검사는 주로 살아있는 상태에서 다양한 형태의 박테리아의 운동성을 검사하는 데 사용되며, 이는 편모의 유무를 간접적으로 결정할 수 있으므로 박테리아 식별에 중요한 역할을 합니다.
박테리아의 운동성을 감지하는 직간접적인 방법이 있다6. 편모를 가진 박테리아는 운동성을 나타내기 때문에 편모의 유무를 감지하여 박테리아가 운동성인지 여부를 간접적으로 검출할 수 있습니다. 예를 들어, 전자 현미경 및 편모 염색에 의해 간접적으로 운동성을 감지하여 박테리아가 운동성이 있음을 나타낼 수 있습니다. 서스펜션 드롭 및 반고체 펑크 방법과 같은 직접적인 방법으로 감지하는 것도 가능합니다.
세균 운동성을 감지하기 위해 학부 미생물학 실험실에서 일반적으로 사용되는 반고체 천자 방법은 세균 성장 방향에 따라 0.4-0.8% 한천을 함유한 반고체 한천 배지에 박테리아를 천자 내로 접종합니다. 박테리아가 펑크 라인을 따라 자라서 주변으로 퍼지면 구름 모양 (브러시 같은) 성장 흔적이 나타나 편모의 존재와 운동성을 나타냅니다. 펑크 라인 성장 흔적이 없으면 박테리아는 편모도 운동성도 없습니다.
그러나이 방법은 박테리아가 무색이고 투명하며 편모 활성은 살아있는 박테리아 및 기타 요인의 생리적 특성과 한천의 농도 및 시험관의 작은 직경에 의해 영향을받는 단점이 있습니다. 또한, 호기성 박테리아는 한천 표면에서의 성장에만 적합하여 박테리아 운동성 관찰에 영향을 미칩니다. 따라서이 실험을 개선하기 위해 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) (무색)를 배지에 첨가하여 TTC 7,8,9,10의 적색 생성물 형성을 촉매하기 위해 세포 내 탈수소 효소를 사용하는 현재의 직접 천자 방법보다 박테리아 운동성을 결정하는 더 신뢰할 수 있고 직관적 인 방법을 확립했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
반고체 배지 방법에 의한 박테리아 운동성의 검출은 많은 요인에 의해 영향을 받는다13,14. 산소(한천 표면의 호기성, 반고체 배지가 있는 튜브 바닥의 비호기성), pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 편모의 생존력에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 운동성 감소 또는 운동성 상실로 이어질 수 있다15. 또한, 일부 점액형 박테?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발(PAPD) 및 중국 약학 대학의 교육 개혁 연구 프로젝트(2019XJYB18)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165 (1934).
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria – A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. . Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
