In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.
Abstract
Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.
Introduction
Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien 1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht3. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt4. Das Zielprotein im Gewebeschnitt wird zunächst mit einem Primärantikörper markiert und der Schnitt wird dann mit einem Sekundärantikörper gegen die Wirtsspezies Immunglobulin des Primärantikörpers markiert. Die Antikörperfärbung ist ein robuster Ansatz zum Nachweis der Lokalisation von Proteinen, der eine hohe optische Auflösung auf intrazellulärer Ebene bietet. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Antikörper im Zebrafisch sehr begrenzt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass etwa 112.000 Antikörper für Mäuse kommerziell verfügbar sind. Allerdings haben sich nur sehr wenige Antikörper im Zebrafisch als zuverlässig erwiesen5.
Stattdessen wurde im Zebrafisch die In-situ-Hybridisierung häufig für die Analyse von Genexpressionsmustern eingesetzt. Diese Methode wurde erstmals in den 1980er Jahren zur Bestimmung der Genexpression in Drosophila-Embryonen verwendet6,7, und seitdem wurde diese Technologie kontinuierlich weiterentwickelt und verbessert. Zunächst wurden radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet, um mRNA-Transkripte nachzuweisen; Die räumliche Auflösung war jedoch relativ gering, und es gab potenzielle Gesundheitsrisiken, die durch die Radioaktivität verursacht wurden. Anschließend stützt sich die In-situ-Hybridisierung auf die mit Digoxigenin (DIG) oder Fluorescein (Fluo) markierten RNA-Sonden, die mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert oder durch fluoreszierende Tyramid-Signalamplifikation (TSA) detektiert werden8,9. Obwohl TSA zum Nachweis von zwei oder drei Genen verwendet wurde, sind die DIG-Markierung von RNA-Sonden und antiDIG AP-konjugierten Antikörpern immer noch hochempfindliche, stabile und weit verbreitete Ansätze für die In-situ-Hybridisierung. Daher sind kommerzialisierte Antikörper in Kombination mit DIG-markierten in situ Sonden nützlich, um Einblicke in die Proteinlokalisierung und -expression eines Gens zu erhalten.
Whole-Mount-Embryonen können aufgrund der geringen optischen Auflösung die räumliche Beziehung zwischen den Genen nicht aufdecken, obwohl Zebrafischembryonen klein und durchsichtig sind10. Daher ist es notwendig, die Expressionsmuster von Genen auf intrazellulärer Ebene zu analysieren. Die Kryosektion ist bei Zebrafischen weit verbreitet, da sie einfach durchzuführen ist und das Antigen effektiv erhalten kann. Daher bietet die In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie in Zebrafisch-Kryoschnitten eine leistungsfähige Möglichkeit, die Expressionsmuster zweier Gene zu analysieren. Eine Kombination aus in situ Hybridisierung und Immunhistochemie wurde auf Zebrafischeangewendet 11. Die Proteinase-K-Behandlung wurde jedoch verwendet, um die Sondenpenetration auf Kosten der Antigenintegrität zu verbessern. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendet dieses Protokoll Erhitzung, um den Antigenabruf zu induzieren. Dieses Protokoll gilt nicht nur für Embryonen verschiedener Stadien und Gewebeabschnitte unterschiedlicher Dicke (14 μm Kopfabschnitte und 20 μm Rückenmarksabschnitte), sondern wurde auch anhand von Genen verifiziert, die in zwei Organen, einschließlich des Kopfes und des Rückenmarks, exprimiert werden.
In diesem Artikel wird beschrieben, wie In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung in Zebrafischembryonen in Kryoschnitten kombiniert werden können. Die Vielseitigkeit dieses Protokolls wird durch die Verwendung einer Reihe von in situ Hybridisierungs- und Immunhistochemie-Kombinationen demonstriert, einschließlich in situ Hybridisierungssonden für zwei verschiedene Neuronen. Diese Methode eignet sich zum Nachweis von mRNA und Proteinen in verschiedenen Regionen und Embryonen unterschiedlichen Alters sowie der Expressionsmuster zweier Gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen14,15,16<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), der Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) und der Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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