Summary

Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.

Abstract

Het verkennen van het therapeutisch potentieel van mesenchymale stamcellen is afhankelijk van het gemak van isolatie, de potentie voor differentiatie en de betrouwbaarheid en robuustheid van de bron. We beschrijven hier een stapsgewijs protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel (uMSCs), hun immunofenotypering en de voortplanting van dergelijke culturen over verschillende passages. In deze procedure is de levensvatbaarheid van de uMSCs hoog omdat er geen enzymatische spijsvertering is. Verder zorgt het verwijderen van bloedvaten, inclusief de navelstrengslagaders en de ader, ervoor dat er geen besmetting is van cellen van endotheeloorsprong. Met behulp van flowcytometrie zijn uMSCs bij isolatie CD45CD34, wat wijst op een afwezigheid van cellen uit de hematopoietische afstamming. Belangrijk is dat ze belangrijke oppervlaktemarkeringen uitdrukken, CD105, CD90 en CD73. Bij het vaststellen van culturen beschrijft dit artikel een efficiënte methode om differentiatie in deze uMSCs in de skeletspierlijn te induceren. Een gedetailleerde analyse van myogene progressie in gedifferentieerde uMSCs onthult dat uMSCs Pax7 uitdrukken, een marker voor myogene voorlopers in de beginfase van differentiatie, gevolgd door de expressie van MyoD en Myf5, en ten slotte een terminale differentiatiemarker, myosine heavy chain (MyHC).

Introduction

De menselijke navelstreng is gecrediteerd om een robuust reservoir van mesenchymale stamcellen te bezitten, die momenteel worden onderzocht voor regeneratieve therapieën vanwege hun robuuste proliferatie- en differentiatiesnelheden, immunomodulerende eigenschappen en het vermogen om cellen te genereren uit alle drie de kiemlagen1. Het navelstrengweefsel bestaat uit meerdere compartimenten zoals het navelstrengbloed, het navelstrengsubendotheel en de Wharton’s jelly (WJ), die op zichzelf drie onduidelijke regio’s omvat- de perivasculaire zone, de intervasculaire zone en de subamnion of de koordvoering (CL)2. Hoewel uMSC’s kunnen worden geïsoleerd van al deze verschillende regio’s en in grote lijnen belangrijke MSC-markers kunnen uitdrukken, is er geen duidelijkheid over de vraag of deze compartimenten dezelfde populatie uMSC’s bevatten of verschillen vertonen in hun differentiatiepotenties3. Daarom vereisen protocollen voor de isolatie van uMSCs een grotere precisie in hun modus en regio van isolatie, de robuuste karakterisering van differentiatiepotentialen en ten slotte een vergelijkende analyse van verschillende compartimenten van het snoer.

In deze context hebben weinig studies verschillen aangetoond in uMSC proliferatieve en differentiatieve potentialen tussen verschillende delen van het koord. Hiervan onthulden vergelijkende analyses tussen uMSCs geïsoleerd van de CL- en WJ-regio’s een groter proliferatief potentieel in CL-afgeleide uMSCs 3,4. In een afzonderlijke studie presteerden WJ-afgeleide uMSCs beter in proliferatietests in vergelijking met perivasculaire cellen (HUCPV)5. Bij het onderzoeken van verschillen tussen van navelstrengbloed afgeleide uMSCs en van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs zonder vasculaire besmetting, werd differentiële expressie van belangrijke MSC-markers gemeld tussen de twee compartimenten, evenals verhoogde proliferatiesnelheden in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs6.

Van de verschillende studies die de differentiatiemogelijkheden van uMSCs onderzoeken, voornamelijk in weefsels van de mesoderm-afstamming, zoals osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen, hebben er maar heel weinig gedetailleerde protocollen opgeleverd voor myogene differentiatie en daaropvolgende karakterisering, evenals vergelijkende analyses tussen verschillende koordcompartimenten. In deze context hebben we een robuust spierdifferentiatieprotocol ontwikkeld en waargenomen dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs superieure myogene differentiatiemogelijkheden vertonen in vergelijking met navelstrengbloed6. Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor de isolatie van uMSCs van het hele navelstrengweefsel zonder cellen geassocieerd met de vasculatuur, hun karakterisering en hun differentiatie in de myogene afstamming.

Protocol

Het gebruik van navelstrengweefsel in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), de Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), de Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana en de Institutional Biosafety Committee, THSTI. Menselijke navelstrengweefselmonsters werden geoogst van termijnbevallingen op het moment van geboorte. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van proefpers…

Representative Results

Het succes van isolatie van uMSCs uit navelstrengweefsel is >95%, in tegenstelling tot de slechte succespercentages van vol navelstrengbloed. Na succesvolle isolatie van uMSCs onthult FACS-analyse dat alle cellen CD34−CD45−CD105+CD90+ zijn. In vergelijkende analyse vertonen uMSCs geïsoleerd uit navelstrengbloed echter heterogene populaties, waarbij een deel van de cellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) vertoont. Bovendien zijn dubbel-positiev…

Discussion

Kritieke stappen
Een cruciale stap in dit protocol is het verzamelen van weefsel onder aseptische omstandigheden, vanaf het moment van levering tot het onderhoud van steriele culturen, voor de gehele duur van de vermeerdering. Tijdens het verzamelen van het snoer is het essentieel dat het snoer geen niet-gesteriliseerd oppervlak raakt en extern wordt afgeveegd met 70% ethanol voordat het wordt verzameld in buizen met PBS aangevuld met antibiotica. Het is belangrijk om de tijd tussen het verzamelen van…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken de heer Ojas Tikoo voor hun hulp bij het filmen en videoproductie. We erkennen ook de hulp die is ontvangen van het GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personeel, verpleegkundigen en senior onderzoeksfunctionarissen in het Gurugram Civil Hospital en Dr. Pallavi Kshetrapal voor hulp bij logistiek. Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan Suchitra Gopinath van het Department of Biotechnology, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

View Video