Summary

Генерация мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировка в линию скелетных мышц

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Описан протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировки в линию скелетных мышц.

Abstract

Изучение терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток зависит от легкости изоляции, способности к дифференцировке, а также надежности и надежности источника. Мы описываем здесь поэтапный протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека (uMSCs), их иммунофенотипирования и распространения таких культур в течение нескольких проходов. В этой процедуре жизнеспособность uMSC высока, потому что нет ферментативного пищеварения. Далее удаление кровеносных сосудов, включая пуповинные артерии и вену, обеспечивает отсутствие загрязнения клеток эндотелиального происхождения. Используя проточную цитометрию, uMSC при выделении получают CD45CD34, что указывает на отсутствие клеток в кроветворной линии. Важно отметить, что они выражают ключевые маркеры поверхности, CD105, CD90 и CD73. После создания культур в данной работе описывается эффективный метод индуцирования дифференцировки в этих умСК в линию скелетных мышц. Детальный анализ миогенной прогрессии в дифференцированных умСК показывает, что умСК экспрессируют Pax7, маркер миогенных предшественников на начальных стадиях дифференцировки, за которым следует экспрессия MyoD и Myf5, и, наконец, терминальный маркер дифференцировки, тяжелая миозиновая цепь (MyHC).

Introduction

Считается, что пуповина человека обладает надежным резервуаром мезенхимальных стволовых клеток, которые в настоящее время исследуются для регенеративной терапии из-за их надежной скорости пролиферации и дифференцировки, иммуномодулирующих свойств и способности генерировать клетки из всех трех зародышевых слоев1. Пуповинная ткань состоит из нескольких компартментов, таких как пуповинная кровь, субэндотелий пуповинной вены и желе Уортона (WJ), которое само по себе охватывает три нечеткие области – периваскулярную зону, межсосудистую зону и субамнион или подкладку пуповины (CL)2. Хотя uMSC могут быть изолированы от всех этих различных регионов и широко выражать ключевые маркеры MSC, нет ясности в отношении того, содержат ли эти отсеки одну и ту же популяцию uMSC или демонстрируют различия в их дифференциационных потенциалах3. Следовательно, протоколы изоляции умСК требуют большей точности в их режиме и области изоляции, надежной характеристики потенциалов дифференциации и, наконец, сравнительного анализа из разных отсеков шнура.

В этом контексте немногие исследования продемонстрировали различия в пролиферативных и дифференцирующих потенциалах uMSC между различными частями пуповины. Из них сравнительный анализ между uMSCs, выделенными из областей CL и WJ, выявил больший пролиферативный потенциал в uMSCs, полученных из CL 3,4. В отдельном исследовании uMSC, полученные из WJ, показали лучшие результаты в анализах пролиферации по сравнению с периваскулярными клетками (HUCPV)5. При изучении различий между uMSC, полученными из пуповинной крови, и uMSC, полученными из пуповинной ткани, лишенными сосудистого загрязнения, сообщалось о дифференциальной экспрессии ключевых маркеров MSC между двумя компартментами, а также об увеличении скорости пролиферации в uMSCs6, полученных из пуповинной ткани.

Из нескольких исследований, изучающих потенциалы дифференциации uMSCs в основном в тканях линии мезодермы, таких как остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии, очень немногие предоставили подробные протоколы для миогенной дифференциации и последующей характеристики, а также сравнительный анализ между различными отсеками пуповины. В этом контексте мы разработали надежный протокол дифференцировки мышц и отметили, что uMSCs, полученные из пуповинной ткани, демонстрируют превосходные возможности миогенной дифференцировки по сравнению с пуповинной кровью6. Здесь подробно описан поэтапный протокол для выделения uMSC из всей ткани пуповины, лишенной клеток, связанных с сосудистой системой, их характеристики и их дифференцировки в миогенную линию.

Protocol

Использование ткани пуповины в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR), Комитетом по институциональной этике, Институтом науки и технологии трансляционного здравоохранения (IEC-THSTI), Комитетом по институциональной этике гражд…

Representative Results

Успех выделения умСК из пуповинной ткани составляет >95%, в отличие от плохих показателей успеха из цельноповинной крови. После успешной изоляции uMSC анализ FACS показывает, что все клетки являются CD34−CD45−CD105+CD90+. Однако в сравнительном анализе uMSCs, выделенные из пупо?…

Discussion

Критические шаги
Критическим этапом в этом протоколе является сбор ткани в асептических условиях, от момента доставки до поддержания стерильных культур, в течение всего периода размножения. Во время сбора пуповины важно, чтобы шнур не касался какой-либо нестерилизованной п?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим г-на Оджаса Тику за их помощь в съемках и видеопроизводстве. Мы также признаем помощь, полученную от сотрудников GARBH-Ini (Междисциплинарная группа по перспективным исследованиям и результатам родов – DBT India), медсестер и старших научных сотрудников в гражданской больнице Gurugram и доктора Паллави Кшетрапала для помощи в логистике. Эта работа была поддержана грантами, предоставленными Сучитре Гопинатх от Департамента биотехнологии, Индия (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

View Video