전단력에 의한 앙상블 힘 분광법
Summary
앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.
Abstract
형광 및 기계화학적 원리에 기반한 단일 분자 기술은 생물학적 감지에서 우수한 감도를 제공합니다. 그러나 높은 처리량 기능이 없기 때문에 이러한 기술의 적용은 생물 물리학에서 제한적입니다. 앙상블 힘 분광법(EFS)은 개별 분자의 기계화학적 연구를 분자 앙상블의 연구로 변환하여 방대한 분자 구조 세트의 조사에서 높은 처리량을 입증했습니다. 이 프로토콜에서 DNA 2차 구조(i-모티프)는 최대 77796/s의 전단 속도로 균질화기 팁의 회전자와 고정자 사이의 전단 흐름에서 펼쳐졌습니다. 유속과 분자 크기가 i-모티프가 경험하는 전단력에 미치는 영향이 입증되었습니다. EFS 기술은 또한 DNA i- 모티프와 리간드 사이의 결합 친화도를 밝혀 냈습니다. 또한, 우리는 전단력(즉, 기계-클릭 화학)에 의해 작동될 수 있는 클릭 화학 반응을 시연했습니다. 이러한 결과는 분자 구조의 형태를 제어하기 위해 전단력을 사용하는 효과를 입증합니다.
Introduction
단일 분자 힘 분광법1(SMFS)에서 개별 분자 구조의 기계적 특성은 원자력 현미경, 광학 핀셋 및 자기 핀셋 2,3,4와 같은 정교한 도구에 의해 연구되었습니다. 힘 생성/검출 설정에서 분자의 동일한 방향성 요구 사항 또는 자기 핀셋 및 소형 원심분리기 힘 현미경(MCF)5,6,7,8의 작은 시야로 인해 제한되므로 SMFS를 사용하여 제한된 수의 분자만 동시에 조사할 수 있습니다. SMFS의 낮은 처리량은 많은 분자 세트의 개입을 필요로하는 분자 인식 분야에서의 광범위한 적용을 방해합니다.
전단 흐름은 거대한 분자 세트에 힘을 가하는 잠재적 솔루션을 제공합니다9. 채널 내부의 액체 흐름에서, 채널 표면에 가까울수록, 유량(10)은 느려진다. 이러한 유속 구배는 경계 표면에 평행한 전단 응력을 유발합니다. 분자가 이 전단 흐름에 배치될 때, 전단력이 장축(11)에 가해짐에 따라, 분자는 그 장축이 유동 방향과 정렬되도록 스스로 방향을 바꾼다. 이러한 방향 변경의 결과로 동일한 유형(핸들의 크기 및 길이)의 모든 분자가 동일한 전단력을 경험하면서 동일한 방향으로 정렬될 것으로 예상됩니다.
이 작업은 DNA i- 모티프에 의해 예시 된 바와 같이 거대한 분자 구조 세트에 전단력을 가하기 위해 이러한 전단 흐름을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 균질화기 팁에서 회전자와 고정자 사이에 전단 흐름이 생성됩니다. 본 연구는 접힌 DNA i- 모티프 구조가 9724-97245 s-1의 전단 속도에 의해 펼쳐질 수 있음을 발견했다. 게다가, L2H2-4OTD 리간드와 i-모티프 사이에 36μM의 해리 상수가 발견되었다. 이 값은 겔 시프트 분석12에 의해 측정된 31 μM의 값과 일치한다. 또한, 현재 기술은 클릭 반응을 촉매하기 위해 킬레이트화된 구리(I)를 노출시킬 수 있는 i-모티프를 전개하는데 사용된다. 따라서 이 프로토콜을 사용하면 합리적인 시간(30분 미만)에 저비용 악기를 사용하여 대규모 i-motif 구조 세트를 펼칠 수 있습니다. 전단력 기술이 힘 분광법의 처리량을 크게 증가시킨다는 점을 감안할 때 이 기술을 앙상블 힘 분광법(EFS)이라고 합니다. 이 프로토콜은 이 전단력 기반 EFS의 적용을 용이하게 하기 위한 실험 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에 설명 된 프로토콜을 사용하면 전단력에 의한 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 전개를 실시간으로 조사 할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 DNA i- 모티프 구조가 전단력에 의해 펼쳐질 수 있음을 강조합니다. 리간드 결합 i-모티프의 풀림과 전단력 작동 클릭 반응은 이 앙상블 힘 분광법의 개념 증명 응용 분야였습니다.
그림 1 은 기기 설정을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 작업은 국립 과학 재단 [CBET-1904921] 및 국립 보건원 [NIH R01CA236350]의 지원을 받았습니다.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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