Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie
Summary
We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.
Abstract
Veel neuromusculaire ziekten, zoals myasthenia gravis (MG), zijn geassocieerd met disfunctie van de neuromusculaire overgang (NMJ), die moeilijk te karakteriseren is in diermodellen vanwege fysiologische verschillen tussen dieren en mensen. Tissue engineering biedt mogelijkheden om in vitro modellen van functionele menselijke NMJ’s te bieden die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. Door optogenetische eiwitten op te nemen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s), genereerden we neuronen die kunnen worden gestimuleerd met specifieke golflengten van licht. Als de NMJ gezond en functioneel is, resulteert een neurochemisch signaal van het motoneuron in spiercontractie. Door de integratie van optogenetica en microfabricage met tissue engineering, hebben we een onbevooroordeelde en geautomatiseerde methodologie vastgesteld voor het karakteriseren van NMJ-functie met behulp van video-analyse. Een gestandaardiseerd protocol werd ontwikkeld voor NMJ-vorming, optische stimulatie met gelijktijdige video-opname en video-analyse van weefselcontractiliteit. Stimulatie van optogenetische motoneuronen door licht om skeletspiercontracties te induceren, recapituuleert de menselijke NMJ-fysiologie en maakt herhaalde functionele metingen van NMJ in de loop van de tijd en in reactie op verschillende inputs mogelijk. We demonstreren het vermogen van dit platform om functionele verbeteringen in neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd te laten zien en de schadelijke effecten van MG-antilichamen of neurotoxinen van patiënten op de NMJ-functie te karakteriseren.
Introduction
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de chemische synaps tussen motoneuronen (MN’s) en skeletspiercellen (SkM) die spiercontractie mogelijk maakt. Toxines, zoals neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), of neuromusculaire ziekten (NMD) zoals myasthenia gravis (MG) kunnen leiden tot degeneratie van de NMJ en vermindering van spiercontrole1. Bio-technische menselijke weefselmodellen kunnen de functionele en fysiologische mechanismen van menselijke NMJ’s beter samenvatten en een groter translationeel potentieel bieden dan diermodellen.
Hoewel diermodellen het begrip van de vorming en functie van de NMJ hebben verbeterd, zijn er significante verschillen tussen menselijke en dierlijke synapsen die de vertaling van resultaten naar mensen beperken en in vivo karakterisering van de NMJ uitdagend maken 2,3,4. Studies hebben duidelijke fysiologische verschillen aangetoond tussen muis en menselijke NMJ’s. Muizen hebben grotere NMJ’s en kleinere actieve zonedichtheden in vergelijking met menselijke NMJ’s4. Bovendien weerspiegelen geneesmiddelenstudies die in diermodellen worden uitgevoerd niet altijd de effecten die zijn gevonden in klinische onderzoeken bij mensen. Gemanipuleerde menselijke weefselmodellen bieden de mogelijkheid om de gezonde ontwikkeling van de NMJ en de pathologie van neuromusculaire ziekten te bestuderen en geneesmiddelenscreenings mogelijk te maken. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s)5 kunnen worden gedifferentieerd in een verscheidenheid aan celtypen, waaronder skeletspiercellen 6,7 en motoneuronen 8,9. hiPSC’s kunnen eenvoudig worden gegenereerd uit patiëntcellen, waardoor een betere ziektemodellering10 en medicijnscreening 11,12 mogelijk is via patiëntspecifieke weefselmodellen.
Tweedimensionale (2D) monolaag co-culturen van SkMs en MN’s missen de morfologie, fenotype, organisatie en functioneel gedrag van fysiologische NMJ’s. NMJ’s vormen zich willekeurig in 2D-cultuur, wat de isolatie van motoreenheden voor analyse remt, nauwkeurige functionele metingen beperkt en voorkomt dat ze worden gebruikt voor herhaalde, systematische experimenten13 . Driedimensionale (3D) weefselmodellen van NMJ’s overwinnen veel van deze beperkingen en herformuleren de morfologische en functionele kenmerken van fysiologische NMJ’s 7,14,15,16,17. Met behulp van dit model worden de twee weefseltypen afzonderlijk ontwikkeld en vervolgens geïntegreerd door axonale groei te sturen, waardoor meer georganiseerde NMJ’s zich kunnen ontwikkelen in vergelijking met 2D-kweeksystemen.
Onze eerdere studie toonde aan dat het combineren van optogenetica met tissue engineering kan zorgen voor nauwkeurige niet-invasieve stimulatie en evaluatie van NMJ-functie18,19. Door middel van genetische manipulatie kunnen lichtgevoelige eiwitten worden geïntegreerd in het genoom van hiPSC’s. Het integreren van channelrhodopsine-2 (ChR2), een ionkanaal dat zich opent als reactie op blauw licht, in het membraan van prikkelbare cellen zoals neuronen zorgt voor contactloze spatiotemporale controle over celactivering 20,21,22. hiPSC’s die ChR2 dragen, kunnen worden gedifferentieerd in optogenetische motoneuronen die gevoelig zijn voor blauw licht, waardoor de noodzaak voor typische invasieve elektroden die neuronen stimuleren wordt weggenomen en ongewenste stimulatie van de spiercellen door elektroden wordt vermeden23. Dit systeem maakt gebruik van optogenetische motoneuronen om contracties in niet-optogenetische skeletspiercellen te stimuleren. Door video-acquisitie en gecontroleerde blauwlichtverlichting te combineren, kunnen de co-gekweekte weefsels tegelijkertijd worden gestimuleerd en opgenomen voor nmj-functie.
MG wordt veroorzaakt door auto-antilichamen gericht op nicotine-acetylcholinereceptoren (AChR), wat resulteert in een verminderde NMJ-functie en spierzwakte24. Het wordt gediagnosticeerd op basis van gepresenteerde symptomen, elektrodiagnose en detectie van auto-antilichamen via serologische bloedtesten. Echter, niet alle auto-antilichamen betrokken bij MG zijn geïdentificeerd, en sommige seronegatieve patiënten worden gediagnosticeerd met MG, maar met geen erkende antilichamen25,26. Ons systeem maakt herhaalde functionele beoordeling van de NMJ mogelijk voor en na de toevoeging van serum van MG-patiënten, waardoor waardevol inzicht wordt verkregen in de functionele en biochemische veranderingen veroorzaakt door de MG-antilichamen18. Ons protocol illustreert hoe 3D in vitro modellen van functionele menselijke NMJ kunnen worden geproduceerd die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. We demonstreren de veelzijdigheid van het systeem in twee platforms, een microfluïdisch apparaat en een groter open-well bioreactorplatform.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit systeem is een gemanipuleerd 3D-menselijk weefselmodel dat optogenetica en videoverwerking combineert om geautomatiseerde en onbevooroordeelde evaluatie van nmj-functie mogelijk te maken. Met behulp van een gestandaardiseerd protocol hebben we het vermogen aangetoond om veranderingen in de NMJ-functie tijdens fysiologische ontwikkeling te meten en de schadelijke effecten van pathologieën zoals blootstelling aan neurotoxine en sera van myasthenia gravis-patiënten te karakteriseren.
Eerder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen dankbaar de financiële steun van de NIH [subsidienummers EB025765 en EB027062], DOD [awardnummer W81XWH-18-1-0095] en de UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). We bedanken de Columbia University Stem Cell Core voor hun hulp en begeleiding bij het herprogrammeren van cellen.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
