Elektroporationsvermittelte Abgabe von Cas9-Ribonukleoproteinen und mRNA in frisch isolierte primäre Maus-Hepatozyten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung primärer Maushepatozyten aus der Leber und zur Elektropolatierung von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine und mRNA, um ein therapeutisches Zielgen zu stören, das mit einer erblichen Stoffwechselerkrankung der Leber assoziiert ist. Die beschriebenen Methoden führen zu einer hohen Lebensfähigkeit und einem hohen Grad an Genmodifikation nach der Elektroporation.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung primärer Maushepatozyten, gefolgt von einer elektroporationsvermittelten Abgabe von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine (RNPs) und mRNA. Primäre Maushepatozyten wurden mit einer dreistufigen retrograden Perfusionsmethode isoliert, was zu hohen Ausbeuten von bis zu 50 × 106 Zellen pro Leber und einer Zelllebensfähigkeit von >85% führte. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Plattieren, Färben und Kultivieren von Hepatozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Elektroporation eine hohe Transfektionseffizienz von 89% bietet, gemessen am Prozentsatz an grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)-positiven Zellen und einer bescheidenen Zelllebensfähigkeit von >35% in Maushepatozyten.
Um den Nutzen dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurde CRISPR-Cas9, das auf das Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase-Gen abzielte, in primäre Maushepatozyten als Proof-of-Principle-Gen-Editing elektropoliert, um ein therapeutisches Gen zu stören, das mit einer vererbten Stoffwechselerkrankung (IMD) der Leber zusammenhängt. Eine höhere On-Target-Editierung von 78% wurde für RNPs beobachtet, verglichen mit 47% Editiereffizienz mit mRNA. Die Funktionalität von Hepatozyten wurde in vitro unter Verwendung eines Albumin-Assays bewertet, der darauf hindeutete, dass die Abgabe von CRISPR-Cas9 als RNPs und mRNA zu einer vergleichbaren Zelllebensfähigkeit in primären Maus-Hepatozyten führt. Eine vielversprechende Anwendung für dieses Protokoll ist die Erstellung von Mausmodellen für menschliche genetische Erkrankungen, die die Leber betreffen.
Introduction
IMDs der Leber sind genetische Störungen, die durch den Mangel an einem entscheidenden Leberenzym gekennzeichnet sind, das am Stoffwechsel beteiligt ist und zur Ansammlung toxischer Metaboliten führt. Ohne Behandlung führen IMDs der Leber zu Organversagen oder vorzeitigem Tod 1,2. Die einzige kurative Option für Patienten mit IMDs der Leber ist die orthotope Lebertransplantation, die aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Spenderorganen und Komplikationen durch die immunsuppressive Therapie nach dem Verfahrenbegrenzt ist 3,4. Nach jüngsten Daten, die vom Organbeschaffungs- und Transplantationsnetzwerk gesammelt wurden, erhalten nur 40% -46% der erwachsenen Patienten auf der Warteliste für Lebertransplantationen ein Organ, während 12,3% dieser Patienten sterben, während sie auf der Wartelistestehen 5. Darüber hinaus haben nur 5% aller seltenen Lebererkrankungen eine von der FDA zugelassene Behandlung6. Es ist klar, dass es einen kritischen Bedarf an neuartigen Behandlungen für IMDs der Leber gibt. Es bedarf jedoch geeigneter Krankheitsmodelle, um neue Therapieoptionen zu entwickeln.
Die Modellierung menschlicher Krankheiten mit In-vitro- und In-vivo-Systemen bleibt ein Hindernis für die Entwicklung wirksamer Therapien und die Untersuchung der Pathologie von IMDs der Leber. Hepatozyten von Patienten mit seltenen Lebererkrankungen sind schwierig zu erhalten7. Tiermodelle sind entscheidend für die Entwicklung eines Verständnisses der Krankheitspathologie und für die Erprobung therapeutischer Strategien. Ein Hindernis ist jedoch die Generierung von Modellen aus Embryonen, die tödliche Mutationen tragen. Zum Beispiel führten Versuche, Mausmodelle des Alagille-Syndroms (ALGS) mit Embryonen zu erstellen, die homozygote Deletionen einer 5-kb-Sequenz in der Nähe des 5′-Endes des Jag1-Gens enthielten, zum frühen Tod der Embryonen8. Darüber hinaus kann die Generierung von Mausmodellen durch Gen-Editing in embryonalen Stammzellen zeit- und ressourcenintensiv sein9. Schließlich treten Mutationen außerhalb des Zielgewebes auf, was zu Störvariablen führt, die die Untersuchung der Krankheit behindern können9. Die somatische Genbearbeitung würde eine einfachere Bearbeitung im Lebergewebe ermöglichen und die Herausforderungen umgehen, die mit der Generierung von Modellen unter Verwendung embryonaler Stammzellen verbunden sind.
Die Elektroporation ermöglicht die Abgabe von CRISPR-Cas9 direkt in den Kern durch Anlegen von Hochspannungsströmen zur Permeabilisierung der Zellmembran und ist mit vielen Zelltypen kompatibel, einschließlich solcher, die für Transfektionstechniken unnachgiebig sind, wie menschliche embryonale Stammzellen, pluripotente Stammzellen und Neuronen10,11,12 . Eine geringe Lebensfähigkeit ist jedoch ein potenzieller Nachteil der Elektroporation. Die Optimierung des Verfahrens kann zu hohen Abgabemengen führen und gleichzeitig die Toxizität begrenzen13. Eine aktuelle Studie zeigt die Machbarkeit der Elektroporation von CRISPR-Cas9-Komponenten in primäre Maus- und humane Hepatozyten als hocheffizienten Ansatz14. Die Ex-vivo-Elektroporation in Hepatozyten hat das Potenzial, angewendet zu werden, um neue Mausmodelle für menschliche IMDs der Leber zu generieren.
Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Isolierung von Maushepatozyten aus der Leber und zur anschließenden Elektroporatierung von CRISPR-Cas9 als RLP-Komplexe, bestehend aus Cas9-Protein und synthetischer Single-Guide-RNA (sgRNA) oder Cas9-mRNA in Kombination mit sgRNA, um ein hohes Maß an On-Target-Gen-Editierung zu erhalten. Darüber hinaus bietet das Protokoll Methoden zur Quantifizierung der Gen-Editing-Effizienz, Lebensfähigkeit und Funktionalität nach der Elektroporation von CRISPR-Cas9 in frisch isolierte Maushepatozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die im Protokoll für die Hepatozytenisolierung beschriebenen Schritte sind eine Herausforderung und erfordern Übung für die Kenntnisse. Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Hepatozytenisolierung aus der Leber. Erstens ist die richtige Kanülierung der unteren Hohlvene für eine vollständige Leberdurchblutung unerlässlich. Das Fehlen einer Blanchierung in der Leber nach der Perfusion deutet auf eine Verschiebung des Katheters hin (Tabelle 1). Die Vena cava inferior (retrograde Perf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC erhielt Mittel vom South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot Grant, unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) der National Institutes of Health, der American Association for the Study of Liver Diseases Foundation und der American Society of Gene & Cell Therapy unter den Fördernummern P30 GM131959, 2021000920, bzw. 2022000099. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der American Society of Gene & Cell Therapy oder der American Association for the Study of Liver Diseases Foundation dar. Der Schaltplan für Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
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