قياس عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا أحادية الخلية والهيتيروبلامي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لقياس عدد نسخ الحمض النووي المطلق للميتوكوندريا (mt) ومستويات حذف mtDNA غير المتجانسة في الخلايا المفردة.
Abstract
الحمض النووي للميتوكوندريا الثديية (mt) هو جزيء حمض نووي صغير ، دائري ، مزدوج الخيوط ، داخل الميتوكوندريا ، يقوم بترميز 13 وحدة فرعية من سلسلة نقل الإلكترون. على عكس الجينوم النووي ثنائي الصبغيات ، تحتوي معظم الخلايا على العديد من النسخ الأخرى من mtDNA ، والتي تتراوح من أقل من 100 إلى أكثر من 200000 نسخة اعتمادا على نوع الخلية. يستخدم رقم نسخة MtDNA بشكل متزايد كعلامة حيوية لعدد من الحالات والأمراض التنكسية المرتبطة بالعمر ، وبالتالي ، أصبح القياس الدقيق لرقم نسخة mtDNA أداة رئيسية في كل من إعدادات البحث والتشخيص. يمكن أن توجد الطفرات في mtDNA ، والتي غالبا ما تحدث على شكل تعدد أشكال نيوكليوتيدات مفردة (SNPs) أو عمليات حذف ، إما في جميع نسخ mtDNA داخل الخلية (تسمى homoplasmy) أو كمزيج من نسخ mtDNA المتحورة و WT (تسمى heteroplasmy). تعد طفرات mtDNA غير المتجانسة سببا رئيسيا لأمراض الميتوكوندريا السريرية ، إما في الأمراض النادرة أو في عدد متزايد من الأمراض الشائعة المتأخرة الظهور مثل مرض باركنسون. يعد تحديد مستوى البلازما غير المتجانسة الموجودة في الخلايا خطوة حاسمة في تشخيص أمراض الميتوكوندريا النادرة وفي الأبحاث التي تهدف إلى فهم الاضطرابات الشائعة في وقت متأخر حيث قد تلعب الميتوكوندريا دورا. تم قياس عدد نسخ MtDNA والبلازما المتغايرة تقليديا عن طريق الفحوصات الكمية (q) القائمة على PCR أو التسلسل العميق. ومع ذلك ، فإن إدخال تقنية ddPCR مؤخرا قد وفر طريقة بديلة لقياس كلا المعلمتين. يوفر العديد من المزايا على الطرق الحالية ، بما في ذلك القدرة على قياس عدد نسخ mtDNA المطلق والحساسية الكافية لإجراء قياسات دقيقة من الخلايا المفردة حتى في أعداد النسخ المنخفضة. يظهر هنا بروتوكول مفصل يصف قياس عدد نسخ mtDNA في الخلايا المفردة باستخدام ddPCR ، ويشار إليه باسم PCR لتوليد القطيرات من الآن فصاعدا ، مع خيار القياس المتزامن للبلازما غير المتجانسة في الخلايا مع حذف mtDNA. كما نوقشت إمكانية توسيع هذه الطريقة لقياس التباين في الخلايا مع mtDNA SNPs.
Introduction
الحمض النووي للميتوكوندريا الثديية (mt) هو جينوم صغير (حوالي 16.5 كيلو بايت) ، وجينوم الحمض النووي الدائري الموجود في مصفوفة الميتوكوندريا التي تشفر 37 جينا ، بما في ذلك اثنين من الحمض النووي الريبي الريبي ، و 22 tRNAs ، و 13 جينا مشفرا للبروتين1. على عكس الجينوم النووي ، الذي يحتوي على نسخة واحدة (فردية) أو نسختين (ثنائي الصبغيات) من كل جين لكل خلية ، فإن mtDNA موجود في نسخ متعددة في الميتوكوندريا لكل خلية ، تتراوح من عشرات النسخ (على سبيل المثال ، الخلايا المنوية الناضجة) إلى مئات الآلاف من النسخ (على سبيل المثال ، البويضات) 2,3. نتيجة لهذه الطبيعة متعددة النسخ هي أن الطفرات في جينوم mtDNA ، والتي قد توجد على شكل تعدد أشكال أحادية النوكليوتيد (SNPs) ، أو الحذف ، أو الازدواجية ، يمكن أن تكون موجودة بمستويات متفاوتة في أي خلية معينة ، وتشكل في أي مكان من 0٪ إلى 100٪ من إجمالي عدد mtDNA في الخلية. يطلق على وجود جينومات mtDNA من النوع البري والمتحور في نفس الخلية اسم heteroplasmy ، وتعد طفرات mtDNA غير المتجانسة المسببة للأمراض سببا رئيسيا لمرض الميتوكوندريا ، مع العديد من المتلازمات العصبية الشائعة المرتبطة بطفرات mtDNA غير المتجانسة الكامنة4.
اثنين من المعلمات الرئيسية التي تسهم في احتمال حدوث طفرة mtDNA غير متجانسة تسبب المرض السريري هي مستوى heteroplasmy ورقم نسخة mtDNA. تظهر العديد من الطفرات غير المتجانسة تأثير عتبة ، حيث تصبح الأنماط الظاهرية الكيميائية الحيوية والسريرية واضحة فقط فوق مستوى معين من البلازما غير المتجانسة ، وعادة ما تكون حوالي 80٪ 5 ، وبالتالي تزداد سوءا مع زيادة التباين4. ومع ذلك ، من المهم أيضا النظر في عدد نسخ mtDNA الموجودة في الخلية ، لأن هذا سيؤثر على عدد جينومات mtDNA من النوع البري (أي “الصحي”) الموجودة على مستوى معين من التباين في الجينوميا. وقد أبرزت الدراسات التي أجريت على مرضى مرض الميتوكوندريا أهمية هذا التفاعل بين الغيرية ورقم النسخة 5,6 ، وأبلغ Filograna et al. مؤخرا عن زيادة في عدد نسخ mtDNA لتخفيف الأعراض على الرغم من عدم تغيير التباين في نموذج الفئران لمرض الميتوكوندريا7.
في حين تم عمل الكثير في السنوات الأخيرة لتحسين فهم التسبب في الأمراض وانتقالها الناجم عن mtDNA heteroplasmy ، فقد تم إجراء معظم هذا العمل على مستوى الأنسجة بدلا من الخلايا ، ومقارنة متوسط مستويات الأنسجة غير المتجانسة وقياسات عدد النسخ المكتسبة من خزعات الأنسجة السائبة وعينات الدم. تسمح بعض التقنيات الراسخة ، مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، بمثل هذه القياسات على المستوى الخلوي 8,9 ؛ ومع ذلك ، فإن الانفجار الأخير لطرق تحليل الخلية الواحدة عالية الإنتاجية ، أو ما يسمى ب “Omics أحادية الخلية”10 ، قد خلق متطلبات للطرق التي يمكنها قياس معلمات mtDNA الحاسمة هذه بدقة على مستوى الخلية الواحدة.
تستفيد طريقة PCR لتوليد القطيرات من التطورات الحديثة في تكنولوجيا الموائع الدقيقة لتحسين الطرق الحالية لقياس تركيزات الحمض النووي غير المعروفة عن طريق تضخيم PCR للأمبليونات المستهدفة المحددة في عينة الحمض النووي11. على عكس qPCR ، حيث يتم تضخيم الحمض النووي للعينة في تفاعل واحد ، مع المعدل النسبي لتراكم منتج PCR بمثابة القراءة ، تقسم هذه الطريقة العينة الأولية إلى آلاف القطرات الفردية ، وبالتالي تقسيم جزيئات الحمض النووي للعينة إلى تفاعلات منفصلة مكانيا12. يستمر تفاعل PCR اللاحق في كل قطرة فردية ، حيث يتراكم منتج PCR فقط في قطرات تحتوي على الحمض النووي المستهدف. نتيجة هذا التفاعل هي إخراج رقمي في شكل مجموعة من القطرات التي تحتوي إما على نسخة من الحمض النووي المستهدف ومنتج PCR المضخم ، أو لا تحتوي على الحمض النووي المستهدف. باستخدام مجسات الحمض النووي الفلورية أو صبغة ربط الحمض النووي المزدوجة (ds) ، يمكن حساب القطرات التي تحتوي على منتج مضخم ، ويمكن استخدام نسبة القطرات “الإيجابية” إلى “السلبية” لحساب العدد المطلق لنسخ الحمض النووي التي كانت موجودة في العينة الأولية. هذا القياس المطلق ، على عكس القياس النسبي المكتسب من تفاعل qPCR ، هو العامل الرئيسي الذي يسمح باستخدام هذه المنهجية للقياس الدقيق لعدد نسخ mtDNA والبلازما المتغايرة في الخلايا المفردة11 ، وقد استخدمت العديد من الدراسات الحديثة بالفعل تقنية PCR لتوليد القطيرات لهذا الغرض13,14 . تقدم هذه المقالة طريقة لقياس عدد نسخ mtDNA وحذف heteroplasmy في خلايا مفردة من كل من أنسجة الإنسان والفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا قابل للتطبيق عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنواع بالإضافة إلى تلك التي نوقشت أعلاه ، على الرغم من أن التحسين الدقيق لتصميمات الفحص الجديدة سيكون مفتاحا لضمان الحفاظ على دقة وتكرار الطريقة عند الابتعاد عن مجموعات التمهيدي / المسبار التي تم التحقق منها مسبقا. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا للدكتور ل بوزيلوفا على مشورته بشأن التحليل الإحصائي لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات. شكرا للدكتور H Zhang على توفير البويضات المستخدمة لتوليد البيانات في الشكل 3C والشكل 4B. تم تنفيذ هذا العمل من قبل SPB في وحدة بيولوجيا الميتوكوندريا التابعة لمجلس البحوث الطبية (MC_UU_00015/9) ، جامعة كامبريدج ، وبتمويل من زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship التي عقدتها PFC (212219/Z/18/Z).
Materials
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G | |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D’Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A–>G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O’Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
