يصف هذا البروتوكول الخلايا الظهارية السنخية المستحثة بالإنسان والمستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من النوع 2 (iAT2s). يمكن استزراع هذه الخلايا كمجالات ذاتية التجديد في ثقافة 3D أو تكييفها مع ثقافة واجهة الهواء السائل (ALI).
في الرئة ، الظهارة السنخية هي حاجز مادي من المحفزات البيئية وتلعب دورا أساسيا في التوازن والمرض. الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AT2s) هي السلف الاختياري لظهارة الرئة البعيدة. يمكن أن ينتج الخلل الوظيفي والإصابة في AT2s عن أمراض الرئة المختلفة ويساهم فيها. وبالتالي ، فإن تحسين فهم بيولوجيا AT2 أمر بالغ الأهمية لفهم بيولوجيا الرئة والمرض. ومع ذلك ، فإن AT2s البشرية الأولية يصعب عزلها بشكل عام ومحدودة العرض. للتغلب على هذه القيود ، يمكن إنشاء الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (iAT2s) المستحثة من قبل الإنسان من خلال بروتوكول تمايز موجه يلخص تطور الرئة في الجسم الحي . تنمو iAT2s في ظروف خالية من التغذية ، وتشارك برنامجا نسخيا مع AT2s الأولية للبالغين من البشر ، وتنفذ الوظائف الرئيسية ل AT2s مثل الإنتاج والتعبئة والتغليف وإفراز الفاعل بالسطح. يفصل هذا البروتوكول طرق الحفاظ على iAT2s ذاتية التجديد من خلال المرور التسلسلي في الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) أو تكييف iAT2s مع ثقافة الواجهة السائلة الهوائية (ALI). يتم إنشاء تعليق أحادي الخلية ل iAT2s قبل الطلاء في مصفوفة غشاء قبو ثلاثي الأبعاد (يشار إليها فيما يلي باسم “المصفوفة”) ، حيث يتم تجميعها ذاتيا في مجالات ظهارية أحادية الطبقات. يمكن فصل iAT2s في ثقافة 3D بشكل متسلسل إلى معلقات أحادية الخلية ليتم تمريرها أو طلاؤها في ثقافة ALI ثنائية الأبعاد. في ثقافة ALI ، تشكل iAT2s طبقة أحادية مستقطبة مع تعرض السطح القمي للهواء ، مما يجعل هذه المنصة قابلة بسهولة للتعرضات البيئية. وبالتالي ، يولد هذا البروتوكول إمدادا لا ينضب من iAT2s ، حيث ينتج ما يزيد عن 1 × 1030 خلية لكل خلية إدخال عبر 15 ممرا مع الحفاظ على برنامج AT2 المشار إليه بتعبير SFTPCtdTomato . تمثل الخلايا الناتجة منصة قابلة للتكرار وذات صلة يمكن تطبيقها لدراسة الطفرات الجينية أو نماذج التعرض البيئي أو أدوية الفحص.
في الرئة ، يكون مجرى الهواء والخلايا الظهارية السنخية أول من يواجه التعرض البيئي المستنشق ، بما في ذلك مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الهباء الجوي المستنشق والمحفزات الضارة مثل دخان السجائر. الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AT2s) ضرورية للحفاظ على توازن الرئة لأنها السلف الاختياري لظهارة الرئة البعيدة ، وتنتج مواد فاعلة بالسطح لتخفيف التوتر السطحي السنخي ، وتركيب الاستجابة المناعية الفطرية للتعرض المستنشق 1,2. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج خلل AT2 عن إصابات الرئة أو الطفرات في الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في AT2s ، مثل SFTPC و SFTPB و ABCA3 3,4,5. اعتمدت الأساليب السابقة لدراسة هذه الطفرات الجينية على نماذج الفئران6 أو النواقل الهندسية المحتوية على الطفرات التي تم إدخالها في خطوط الخلايا الخالدة7. لذلك ، هناك حاجة إلى منصات يمكنها نمذجة آثار الاضطرابات الجينية والبيئية على AT2s في أنواع الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وفي نظام منتج في المختبر لفهم الدور الذي تلعبه AT2s في الصحة والمرض.
من حيث نمذجة التعرضات المحمولة جوا ، تم استخدام مزارع واجهة الهواء السائل (ALI) للخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء بنجاح للكشف عن الاستجابات الجزيئية الرئيسية لدخان السجائر8 ونمذجة عدوى مجرى الهواء 9,10. نظام زراعة ALI مماثل للظهارة السنخية ، وهو موقع رئيسي للعدوى أو الإصابة في المرض ، أقل تطورا بكثير مقارنة بنظام النموذج الظهاري في مجرى الهواء. تم استزراع خطوط الخلايا الخالدة في ALI كوكيل للظهارة السنخية11,12 ، ولكن هذه الخطوط الخلوية متميزة نسخيا عن الخلايا الظهارية السنخية الأولية 13 وتفتقر إلى الآلات الخلوية الرئيسية ، مثل القدرة على إفراز المواد الخافضة للتوتر السطحي أو تشكيل تقاطعات ضيقة في ALI 12. يمكن استزراع AT2s البشري الأولي في مجالات ثلاثية الأبعاد في وجود الخلايا الليفية 1,14 ولكنها تخضع لقيود ، بما في ذلك محدودية إمكانية الوصول من الرئتين الخارجيتين وميلها إلى الشيخوخة أو فقدان النمط الظاهري الخلوي في معظم الثقافات حتى الآن. تمثل هذه الخصائص حواجز أمام الاعتماد الواسع النطاق ل AT2 الأولي في الدراسات المخبرية ، على الرغم من إحراز تقدم حديث في تحسين الثقافات ثلاثية الأبعاد الخالية من التغذية لتوسيع AT2s الأولية15،16،17،18.
تم تطوير بروتوكولات التمايز الموجهة لتلخيص المعالم التنموية في الجسم الحي لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من الإنسان (iPSC) من النوع 2 من الخلايا الظهارية السنخية (iAT2s)19. تنمو iAT2s كمجالات ذاتية التجديد في ثقافة خالية من المصل ثلاثي الأبعاد في وسط محدد يحتوي على CHIR99021 و KGF و dexamethasone و cAMP و 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ، يطلق عليه “CK + DCI”19 ، في حالة عدم وجود مغذيات الخلايا الليفية ويمكن استزراعه لمدة >20 مقطع20,21. علاوة على ذلك ، تشترك iAT2s في برنامج النسخ مع AT2s الأولية للبالغين ، وتشكل أجساما صفائحية ، وتنتج وتعبئتها الفاعل بالسطح19،21،22. يفصل هذا البروتوكول المرور التسلسلي ل iAT2s عن طريق فصل الخلايا إلى تعليق أحادي الخلية. في هذه المرحلة ، يمكن إعادة طلاء iAT2s وتوسيعها بشكل أكبر في ثقافة 3D أو طلائها في ثقافة 2D ALI23. يمكن استخدام هذه الطرق لدراسة البيولوجيا الجوهرية ل AT2s في التوازن والمرض20,22 ولاستجواب آثار المركبات أو المحفزات في منصة قابلة للتطوير وذات صلة فسيولوجية 23,24 ، كما هو موضح سابقا.
يحافظ AT2s على توازن الرئة ، ويمكن أن يسبب خلل هذه الخلايا السنخية الرئيسية وينتج عن أمراض الرئة المختلفة. نظرا لصعوبة الوصول إلى AT2s البشرية الأولية وعزلها ، يتم إنشاء iAT2s. من خلال تطبيق طرق التمايز الموجهة الموضحة في مكان آخر25 والتوسع وبذر الخلايا الموصوفة هنا ، يمكن تمييز iPSCs الناتجة عن أي فرد إلى iAT2s ذاتية التجديد بقوة ، وبالتالي توفير خلايا خاصة بالمريض للبحوث الطبية الحيوية ، بما في ذلك الدراسات التطويرية الأساسية للبحوث الطبية الحيوية ، أو نمذجة الأمراض ، أو العلاجات القائمة على الخلايا ، أو شاشات الأدوية. يفصل البروتوكول الحالي طريقة لفصل iAT2s إلى تعليق أحادي الخلية ، والذي يمكن بعد ذلك إعادة طلائه في 3D Matrigel لتوليد الأسياج الهوائية لتوسيع الخلية أو إعادة طلائها في ثقافة ALI ثنائية الأبعاد لمزيد من التجارب.
يحتوي البروتوكول على العديد من الخطوات الحاسمة لضمان النجاح في تمرير وإعادة الطلاء في كل من ثقافات 3D و ALI. يجب تقليل التتبع الميكانيكي إلى الحد الأدنى ، لأن السحب المفرط يمكن أن يقلل من صلاحية الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كثافة البذر من iAT2s في كل من ثقافات 3D و 2D ALI أمر بالغ الأهمية. بالنسبة للثقافة ثلاثية الأبعاد ، بشكل عام ، فإن 400 خلية / ميكرولتر من 3D Matrigel هي الأمثل لمعظم خطوط iPSC. ومع ذلك ، فإن مجموعة من الكثافات من 100-500 خلية / ميكرولتر كانت ناجحة في بعض الأحيان ، وقد تكون هناك حاجة إلى تحسين الكثافة لخطوط الخلايا المختلفة. بالنسبة لثقافة ALI ، يعد تحسين كثافة البذر ل iAT2s على إدخالات مزرعة الخلايا أمرا ضروريا أيضا لتحقيق طبقة أحادية متقاربة من الخلايا بعد 48 ساعة من البذر (أي في يوم الرفع الجوي). تتطلب بعض خطوط iAT2 المزيد من الخلايا لكل إدراج. وبالتالي ، إذا كان استكشاف الأخطاء وإصلاحها مطلوبا ، فمن المستحسن نطاق يتراوح بين 160000 و 300000 خلية / إدراج لإدراج مزرعة الخلايا 24 بئرا. يمكن أيضا توسيع نطاق الثقافات ثلاثية الأبعاد إلى لوحات 24 و 48 بئرا من خلال الحفاظ على كثافة البذر عند 400 خلية / ميكرولتر من المصفوفة ثلاثية الأبعاد وتقليل حجم قطرات المصفوفة إلى 25 ميكرولتر و 20 ميكرولتر ، على التوالي. يمكن تحجيم مزارع ALI إلى إدراج 96 بئرا من مزارع الخلايا عن طريق طلاء كل إدراج ب 30 ميكرولتر من المصفوفة ، وطلاء 80000 خلية في 30 ميكرولتر لكل إدراج ، والتغذية ب 150 ميكرولتر من الوسائط القاعدية الجانبية لكل بئر. يجب قياس كثافة البذر وأحجام المصفوفة والوسائط وتحسينها وفقا لتنسيقات الألواح الأخرى.
أحد قيود هذا البروتوكول هو أن الخلايا المستخدمة في طلاء ALI يجب أن تكون منقية بما فيه الكفاية لتكون NKX2-1+ و SFTPC + 19,20,21,23 لتشكيل iAT2 ALIs ، وقد يختلف تكوين ثقافة ALI من سطر إلى آخر. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بتوسيع وتوليد ثقافات AT2 فقط ، مما يوفر نظاما نموذجيا اختزاليا يعتمد على نوع خلية سنخية رئيسية واحدة. الأهم من ذلك ، كانت أنواع الخلايا السنخية الأخرى ذات الصلة ، مثل الخلايا السنخية من النوع 1 ، مفقودة من هذه المنصات. وقد حققت مجموعات أخرى نجاحا في زراعة AT2s البشرية الأولية ككرويات أو ثقافات نمطية عضوية مع أو بدون الخلايا الليفية 1،14،15،16،17; ومع ذلك ، تميل AT2s البشرية الأولية إلى فقدان تعبيرها عن المواد الخافضة للتوتر السطحي الرئيسية عند استزراعها في ثقافة ثنائية الأبعاد طبيعية دون شروط ALI26. علاوة على ذلك ، أظهرت الأبحاث الحديثة أن iAT2s تعبر عن علامات تكاثر أعلى وعلامات نضج AT2 أقل من AT2s27 الأولية البشرية الجديدة وغير المستزرعة. على الرغم من هذه الاختلافات بين iAT2s و AT2s البشرية الأولية الطازجة ، وجدنا أنه حتى AT2s الأولية المستزرعة أظهرت اختلافات نسخية من AT2s27 الأولية الطازجة وغير المستزرعة ، وبالتالي استنتجنا أن هذه النماذج في المختبر لها نقاط قوة وقيود مختلفة للنمذجة في بيولوجيا الرئة في الجسم الحي.
يمكن تطبيق منصة iAT2 لدراسة الطفرات الجينية من iPSCsالمشتقة من المريض 19,20. ويمكن أيضا توسيع نطاق النظام إلى حد كبير لاستيعاب فحص الأدوية عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن iAT2 ALIs مناسبة للتعرض البيئي مثل العدوى الفيروسية أو البكتيرية أو التعرض لدخان السجائر أو بخار السجائر الإلكترونية أو الهباء الجوي الآخر23. باختصار ، يسمح هذا البروتوكول لتوليد كل من ثقافات 3D و 2D ALI من iAT2s بزراعة طويلة الأجل لنوع خلية ذات صلة بالمرض ويوفر منصة فسيولوجية قابلة للتطوير تمكن من استخدام هذه الخلايا في العديد من التطبيقات.
The authors have nothing to disclose.
نشكر بصدق أعضاء مختبرات ويلسون وكوتون وهوكينز على مناقشاتهم المفيدة. كما أننا ممتنون جدا لجريج ميلر (مدير مختبر CReM) وماريان جيمس (مدير iPSC الأساسي) لدعمهما الذي لا يقدر بثمن. نشكر Brian Tilton و BUMC Flow Cytometry Core على مساعدتهم الفنية في فرز الخلايا (بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة #1S10OD021587-01A1). تم دعم هذا العمل من خلال زمالة CJ Martin Early Career من المجلس الوطني الأسترالي للصحة والبحوث الطبية الممنوحة ل RBW. منح المعاهد الوطنية للصحة F30HL147426 إلى KMA ؛ جائزة I.M. Rosenzweig للباحث المبتدئ من مؤسسة التليف الرئوي وجائزة منحة تجريبية متكاملة من خلال معهد العلوم السريرية والانتقالية بجامعة بوسطن (1UL1TR001430) إلى KDA ؛ المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (P2ELP3_191217) إلى ABA; تمنح المعاهد الوطنية للصحة U01HL148692 و U01HL134745 و U01HL134766 و R01HL095993 إلى DNK ؛ وتمنح المعاهد الوطنية للصحة U01TR001810 و R01DK101510 و R01DK117940 الممنوحة ل AAW ؛ يتم دعم صيانة iPSC والخدمات المصرفية والمشاركة من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة NO1 75N92020C00005. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |