Misurazione della vasorilassazione endotelio-dipendente nell'aorta toracica del topo mediante miografia tensometrica a camera di piccolo volume
Summary
Il presente protocollo descrive i concetti e l’applicazione tecnica della tecnica del miografo tensometrico utilizzando un sistema miografo multicamera nella valutazione sperimentale ex vivo della funzione endoteliale aortica del topo.
Abstract
La miografia tensometrica a camera di piccolo volume è una tecnica comunemente usata per valutare la contrattilità vascolare dei vasi sanguigni piccoli e grandi negli animali da laboratorio e nelle piccole arterie isolate dal tessuto umano. La tecnica consente ai ricercatori di mantenere i vasi sanguigni isolati in un ambiente strettamente controllato e standardizzato (quasi fisiologico), con la possibilità di adattarsi a vari fattori ambientali, sfidando i vasi isolati con diversi agenti farmacologici che possono indurre vasocostrizione o vasodilatazione. La camera miografica fornisce anche una piattaforma per misurare la reattività vascolare in risposta a vari ormoni, inibitori e agonisti che possono influire sulla funzione della muscolatura liscia e degli strati endoteliali separatamente o contemporaneamente. La parete dei vasi sanguigni è una struttura complessa costituita da tre diversi strati: l’intima (strato endoteliale), i media (muscoli lisci e fibre di elastina) e l’avventizia (collagene e altro tessuto connettivo). Per ottenere una chiara comprensione delle proprietà funzionali di ogni strato, è fondamentale avere accesso a una piattaforma sperimentale e a un sistema che consenta un approccio combinato per studiare tutti e tre gli strati contemporaneamente. Tale approccio richiede l’accesso a una condizione semi-fisiologica che imiterebbe l’ambiente in vivo in un ambiente ex vivo . La miografia tensometrica a camera di piccolo volume ha fornito un ambiente ideale per valutare l’impatto di segnali ambientali, variabili sperimentali o agonisti e antagonisti farmacologici sulle proprietà vascolari. Per molti anni, gli scienziati hanno utilizzato la tecnica del miografo tensometrico per misurare la funzione endoteliale e la contrattilità della muscolatura liscia in risposta a diversi agenti. In questo rapporto, un sistema miografico tensometrico a camera di piccolo volume viene utilizzato per misurare la funzione endoteliale nell’aorta isolata del topo. Questo rapporto si concentra su come la miografia tensometrica a camera di piccolo volume può essere utilizzata per valutare l’integrità funzionale dell’endotelio in piccoli segmenti di una grande arteria come l’aorta toracica.
Introduction
Negli ultimi decenni, il sistema di miografia a camera piccola è stato utilizzato per misurare la reattività di diversi strati di pareti dei vasi sanguigni in risposta a vari agenti farmacologici e neurotrasmettitori in un ambiente ex vivo, in tempo reale. La reattività vascolare è una componente importante di un vaso sanguigno funzionale sano ed è fondamentale per la regolazione del flusso sanguigno e della perfusione nel sistema vascolare periferico e cerebrale1. All’interno della parete dei vasi sanguigni, l’interazione tra strati endoteliali e muscolari lisci è un importante determinante del tono vascolare, che è anche costantemente influenzato da cambiamenti strutturali nello strato di tessuto connettivo che circonda la parete dei vasi sanguigni (avventizia).
Lo strato endoteliale controlla la vasomozione rilasciando alcuni fattori vasodilatatori, tra cui ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fattore iperpolarizzante derivato dall’endotelio (EDHF), o producendo agenti vasocostrittori come endotelina-1 (ET-1) e trombossano (TXA2)2,3,4. Tra questi fattori, l’NO è stato ampiamente studiato e i suoi importanti ruoli regolatori in altre funzioni cellulari critiche come l’infiammazione, la migrazione, la sopravvivenza e la proliferazione sono stati altamente citati nella letteratura scientifica 2,5.
Nel campo della biologia vascolare, la miografia camerale ha fornito ai fisiologi vascolari e ai farmacologi uno strumento prezioso e affidabile per misurare la funzione endoteliale in un sistema semi-fisiologico strettamente controllato1. Attualmente, ci sono due diversi sistemi miografici disponibili per gli scienziati: miografia tensometrica (isometrica) a filo (o pin) e miografia a pressione. In un sistema di miografia a filo, il vaso sanguigno è teso tra due fili o perni, consentendo la misurazione isometrica dello sviluppo di forza o tensione nella parete del vaso sanguigno, mentre la miografia a pressione è una piattaforma preferibile per le misurazioni della reattività vascolare nelle piccole arterie di resistenza, dove i cambiamenti nella pressione sanguigna sono considerati lo stimolo principale per i cambiamenti nel tono vascolare e nella vasomozione. C’è un accordo generale sul fatto che, per le piccole arterie di resistenza come le arterie mesenteriche e cerebrali, la miografia pressoria crea una condizione più vicina alle condizioni fisiologiche nel corpo umano. Il miografo a camera piccola può essere utilizzato per vasi con diametri molto piccoli (200-500 μm) a vasi molto più grandi come l’aorta.
Mentre il miografo a filo è un potente sistema per registrare la tensione dei vasi sanguigni in condizioni isometriche, il miografo a pressione è un sistema più appropriato per misurare i cambiamenti nel diametro del vaso in risposta ai cambiamenti nelle condizioni isobariche. I cambiamenti di diametro nel vaso in risposta a cambiamenti di pressione o flusso sono molto più grandi in una piccola arteria muscolare (arteriola) rispetto alle grandi arterie elastiche come l’aorta. Per questi motivi, il miografo a pressione è considerato uno strumento migliore per i piccoli vasi sanguigni con vasoreattività sostanziale1. Uno degli altri punti di forza pratici della miografia tensometrica a camera multicamera a piccolo volume è che si può discernere il contributo di diversi meccanismi alla reattività vascolare studiando più (fino a quattro) segmenti della stessa arteria e dallo stesso animale per ridurre la variabilità e produrre dati robusti e conclusivi. È anche relativamente facile da configurare e mantenere tecnicamente. Vasi di quasi tutte le dimensioni possono essere studiati con un miografo a filo. È una soluzione più economica per valutare la funzione vascolare ed è una buona alternativa alla miografia a pressione negli esperimenti in cui la lunghezza del vaso sezionato è troppo breve per il protocollo del miografo a pressione.
Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per la valutazione della funzione endoteliale nell’anello aortico toracico isolato del topo utilizzando perni di montaggio nella tecnica di miografia tensometrica a camera a piccolo volume utilizzando il sistema miografico multicamera DMT-620 (DMT-USA). Questo protocollo utilizza un topo maschio C57BL6 di 6 mesi con un peso medio compreso tra 25-35 g. Fortunatamente, questo protocollo può essere applicato a vari tipi e pesi di animali, considerando l’ampia gamma di tipi di vasi e diametri per cui questo protocollo può essere utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il campo della biologia vascolare si basa fortemente su strumenti che aiutano i ricercatori a valutare l’integrità funzionale e strutturale della parete dei vasi sanguigni. Richiede anche un’attenzione particolare sulle interazioni dirette e indirette tra i tre strati di vasi sanguigni: l’intima, i media e l’avventizia. Tra questi tre strati, l’intima è formata da un monostrato di cellule endoteliali e ha una funzione molto importante nella regolazione della salute vascolare e dell’emostasi.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health (R15HL145646) e del Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
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