Простой протокол анализа ям для визуализации и количественной оценки остеокластической резорбции in vitro
Summary
Здесь мы представляем простую и эффективную процедуру анализа резорбционных ям с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция.
Abstract
Зрелые остеокласты представляют собой многоядерные клетки, которые могут разлагать кости за счет секреции кислот и ферментов. Они играют решающую роль при различных заболеваниях (например, остеопорозе и раке костей) и поэтому являются важными объектами исследований. In vitro их активность может быть проанализирована путем образования резорбционных ямок. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция (CaP), которые можно легко визуализировать и количественно оценить. Предшественники остеокластов, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs), культивировали на покрытых пластинах в присутствии остеокластогенных стимулов. После 9 дней инкубации остеокласты были зафиксированы и окрашены для флуоресцентной визуализации, в то время как покрытие CaP было противопоставлено кальцеину. Для количественной оценки рассасываемой области покрытие CaP на пластинах окрашивали 5% AgNO3 и визуализировали с помощью визуализации brightfield. Площадь резорбционной ямы была количественно определена с помощью ImageJ.
Introduction
Остеокласты (OC) представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из гемопоэтических стволовых клеток (HSC), играющие ключевую роль в ремоделировании кости вместе с остеобластами1. Вызванные половыми гормонами, иммунологические и злокачественные заболевания костей, которые разрушают кости системно или локально, обусловлены избыточной остеокластической активностью, включая остеопороз, связанный с менопаузой2, ревматоидный артрит3, пародонтоз4, заболевание кости миеломы5 и остеолитическое метастазирование в кости6. Напротив, дефекты образования и функции OC также могут вызывать остеопетроз7. ГСК подвергаются дифференцировке в предшественники OC при стимуляции макрофагов колониестимулирующим фактором (M-CSF, символ гена ACP5). В присутствии как M-CSF, так и рецепторного активатора лиганда NF-κB (RANKL, символ гена TNFSF11), предшественники OC дифференцируются далее в мононуклеарные OC и впоследствии сливаются, чтобы стать многоядернымиOC 8,9,10. Оба цитокина M-CSF и RANKL незаменимы и достаточны для индукции остеокластических маркеров, таких как рецептор кальцитонина (CT), активатор рецептора ядерного фактора κ B (RANK), протонная помпа V-АТФазы, альфа-субъединица хлоридного канала 7 (CIC-7), интегрин β3, тартраторезистентная кислая фосфатаза (TRAP, символ гена ACP5), лизосомальный цистеинпротеазный катепсин K (CTSK) и матрикс металлопептидаза 9 (MMP9). Активированные ОС образуют зону уплотнения на поверхности кости путем образования актинового кольца с взъерошенной границей11,12. В пределах зоны уплотнения ОС опосредуют резорбцию путем секреции протонов через протонный насос V-АТФазы 12,13, MMP914 и CTSK15, что приводит к образованию лакун.
Для экспериментов in vitro предшественники OC могут быть получены путем расширения макрофагов костного мозга из бедренной и большеберцовойкостей мышей 16,17, а также путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs) из образцов крови и пышных покрытий 18,19,20 или путем дифференцировки увековеченных мышиных моноцитарных клеток RAW 264,7 21,22.
В настоящем протоколе мы описываем остеокластический резорбционный анализ в пластинах клеточных культур, покрытых CaP, с использованием OC, полученных из первичных PBMCs. Используемый здесь метод клеточных культуральных пластин с покрытием CaP принят и усовершенствован из метода, описанного ранее Patntirapong et al.17 и Maria et al.21. Для получения предшественников OC PBMC выделяют центрифугированием градиента плотности и расширяют, как описано ранее20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем простой и надежный метод анализа остеокластической резорбции с использованием OC, полученных и расширенных in vitro из PBMCs. Используемые пластины для культивирования клеток с покрытием CaP могут быть легко подготовлены и визуализированы с использованием лабораторны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично профинансирована Китайским стипендиальным советом [CSC No 201808440394]. W.C. финансировался CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. 癌症研究. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
