Здесь мы представляем простую и эффективную процедуру анализа резорбционных ям с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция.
Зрелые остеокласты представляют собой многоядерные клетки, которые могут разлагать кости за счет секреции кислот и ферментов. Они играют решающую роль при различных заболеваниях (например, остеопорозе и раке костей) и поэтому являются важными объектами исследований. In vitro их активность может быть проанализирована путем образования резорбционных ямок. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция (CaP), которые можно легко визуализировать и количественно оценить. Предшественники остеокластов, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs), культивировали на покрытых пластинах в присутствии остеокластогенных стимулов. После 9 дней инкубации остеокласты были зафиксированы и окрашены для флуоресцентной визуализации, в то время как покрытие CaP было противопоставлено кальцеину. Для количественной оценки рассасываемой области покрытие CaP на пластинах окрашивали 5% AgNO3 и визуализировали с помощью визуализации brightfield. Площадь резорбционной ямы была количественно определена с помощью ImageJ.
Остеокласты (OC) представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из гемопоэтических стволовых клеток (HSC), играющие ключевую роль в ремоделировании кости вместе с остеобластами1. Вызванные половыми гормонами, иммунологические и злокачественные заболевания костей, которые разрушают кости системно или локально, обусловлены избыточной остеокластической активностью, включая остеопороз, связанный с менопаузой2, ревматоидный артрит3, пародонтоз4, заболевание кости миеломы5 и остеолитическое метастазирование в кости6. Напротив, дефекты образования и функции OC также могут вызывать остеопетроз7. ГСК подвергаются дифференцировке в предшественники OC при стимуляции макрофагов колониестимулирующим фактором (M-CSF, символ гена ACP5). В присутствии как M-CSF, так и рецепторного активатора лиганда NF-κB (RANKL, символ гена TNFSF11), предшественники OC дифференцируются далее в мононуклеарные OC и впоследствии сливаются, чтобы стать многоядернымиOC 8,9,10. Оба цитокина M-CSF и RANKL незаменимы и достаточны для индукции остеокластических маркеров, таких как рецептор кальцитонина (CT), активатор рецептора ядерного фактора κ B (RANK), протонная помпа V-АТФазы, альфа-субъединица хлоридного канала 7 (CIC-7), интегрин β3, тартраторезистентная кислая фосфатаза (TRAP, символ гена ACP5), лизосомальный цистеинпротеазный катепсин K (CTSK) и матрикс металлопептидаза 9 (MMP9). Активированные ОС образуют зону уплотнения на поверхности кости путем образования актинового кольца с взъерошенной границей11,12. В пределах зоны уплотнения ОС опосредуют резорбцию путем секреции протонов через протонный насос V-АТФазы 12,13, MMP914 и CTSK15, что приводит к образованию лакун.
Для экспериментов in vitro предшественники OC могут быть получены путем расширения макрофагов костного мозга из бедренной и большеберцовойкостей мышей 16,17, а также путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs) из образцов крови и пышных покрытий 18,19,20 или путем дифференцировки увековеченных мышиных моноцитарных клеток RAW 264,7 21,22.
В настоящем протоколе мы описываем остеокластический резорбционный анализ в пластинах клеточных культур, покрытых CaP, с использованием OC, полученных из первичных PBMCs. Используемый здесь метод клеточных культуральных пластин с покрытием CaP принят и усовершенствован из метода, описанного ранее Patntirapong et al.17 и Maria et al.21. Для получения предшественников OC PBMC выделяют центрифугированием градиента плотности и расширяют, как описано ранее20.
Здесь мы описываем простой и надежный метод анализа остеокластической резорбции с использованием OC, полученных и расширенных in vitro из PBMCs. Используемые пластины для культивирования клеток с покрытием CaP могут быть легко подготовлены и визуализированы с использованием лабораторны…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично профинансирована Китайским стипендиальным советом [CSC No 201808440394]. W.C. финансировался CSC.
AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |