Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren
Summary
Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.
Abstract
Het human skin xenograft model, waarbij de menselijke donorhuid wordt getransplanteerd op een immunodeficiënte muisgastheer, is een belangrijke optie voor translationeel onderzoek in de huidimmunologie. Murine en menselijke huid verschillen aanzienlijk in anatomie en samenstelling van immuuncellen. Daarom hebben traditionele muismodellen beperkingen voor dermatologisch onderzoek en medicijnontdekking. Succesvolle xenotransplantaties zijn echter technisch uitdagend en vereisen een optimale voorbereiding van de monster- en muistransplantaatlocatie voor de overleving van transplantaten en gastheer. Het huidige protocol biedt een geoptimaliseerde techniek voor het transplanteren van menselijke huid op muizen en bespreekt noodzakelijke overwegingen voor downstream experimentele doelen. Dit rapport beschrijft de juiste voorbereiding van een menselijk donorhuidmonster, assemblage van een chirurgische opstelling, muis- en chirurgische sitevoorbereiding, huidtransplantatie en postoperatieve monitoring. Naleving van deze methoden maakt het mogelijk om xenografts gedurende meer dan 6 weken na de operatie te onderhouden. De onderstaande technieken maken maximale entefficiëntie mogelijk dankzij de ontwikkeling van technische controles, steriele techniek en pre- en postoperatieve conditionering. Passende prestaties van het xenograftmodel resulteren in langlevende menselijke huidtransplantatiemonsters voor experimentele karakterisering van de menselijke huid en preklinisch testen van verbindingen in vivo.
Introduction
Muismodellen worden vaak gebruikt om conclusies te trekken over menselijke biologie en ziekte, deels vanwege hun experimentele reproduceerbaarheid en capaciteit voor genetische manipulatie. De fysiologie van muizen vat echter de menselijke orgaansystemen, met name de huid, niet volledig samen en heeft daarom beperkingen voor gebruik als preklinisch model bij de ontwikkeling van geneesmiddelen1. Anatomische verschillen tussen muis en menselijke huid omvatten verschillen in epitheliale diktes en architectuur, gebrek aan murine eccriene zweetklieren en variaties in haarcyclus2. Bovendien verschillen zowel de aangeboren als de adaptieve armen van het immuunsysteem tussen de twee soorten3. Muizenhuid bevat een unieke immuunpopulatie van dendritische epidermale T-cellen (DETC’s), heeft een hogere abundantie van dermale γδ T-cellen en varieert in lokalisatie van immuuncelsubsets in vergelijking met menselijk weefsel4. Daarom hebben experimentele bevindingen met betrekking tot menselijke huidbiologie en ontsteking baat bij validatie met menselijk weefsel. Hoewel in vitro en organoïde kweeksystemen op grote schaal worden gebruikt om menselijk weefsel te bestuderen, worden deze systemen beperkt door afwezige of onvolledige immuunreconstitutie en een gebrek aan verbinding met perifere vasculatuur5. Het gehumaniseerde xenograft huidtransplantatiemodel heeft tot doel therapeutische of biologische manipulatie van immuun- en niet-immuunroutes in menselijke weefsels in vivo mogelijk te maken.
Het xenograftmodel van de menselijke huid is gebruikt om huidfysiologie en farmacologie te bestuderen, immuunafstoting en -reacties te analyseren, menselijke huidkankermechanismen te ontleden en huidziekten en wondgenezing te begrijpen6. Hoewel het xenograftmodel van toepassing is op meerdere gebieden van huidonderzoek, heeft het een lagere doorvoer dan in vitro studies en mist het het gemak van genetische manipulatie dat wordt gebruikt in muismodellen. Tijdspunten binnen dit model kunnen variëren van weken tot maanden, en succesvol enten vereist geschikte faciliteiten en apparatuur om deze operaties uit te voeren. Het xenograftmodel biedt echter biologische en fysiologische context aan experimenten, terwijl organoïde kweeksystemen, zoals weefselexplantaten, vaak een groot aantal bewegende delen, zoals exogene signalen, met specifieke tijdsintervallen vereisen7. Daarom kan dit model het best worden gebruikt om bevindingen die in vitro en binnen muismodellen zijn waargenomen, verder te valideren, of voor werk dat anders biologisch niet haalbaar is. Het juiste gebruik van het xenograftmodel biedt een unieke kans om intact menselijk weefsel in vivo te bestuderen en te manipuleren.
Optimalisatie van het xenograft huidtransplantatiemodel is gebaseerd op tientallen jaren van onderzoek om de integriteit van het transplantaat in de loop van de tijd te behouden. Cruciaal voor dit proces is het gebruik van de niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketenreceptor (NSG) muis, die B- en T-adaptieve immuuncellen, functionele NK-cellen mist en tekortkomingen heeft in macrofaag en dendritische cellen8. De immunodeficiënte aard van deze NSG-gastheren maakt de transplantatie van menselijke hematopoëtische cellen, van patiënten afgeleide kankers en huid 8,9,10 mogelijk. Ondanks deze immunosuppressieve gastheeromgeving is aanvullende onderdrukking van neutrofiele immuunresponsen bij muizen door anti-GR1-toediening noodzakelijk voor transplantaatsucces10. De belangrijkste obstakels bij het transplanteren van intact weefsel zijn infectie, afstoting en moeilijkheden bij het herstellen van de bloedtoevoer naar het transplantaat, wat soms leidt tot verlies van dermale en epidermale integriteit11. Technieken, waaronder toediening van anti-FR1 en het gebruik van de juiste graftdiepte, verbeteren de overleving van het transplantaat10. Zorgvuldige optimalisatie maakt het mogelijk om menselijke xenograft huidtransplantaties uit te voeren op NSG-muizen met een hoge efficiëntie en overlevingskansen, variërend van 90% -100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidtransplantatiemodel van de muis xenograft is een belangrijke techniek om immuunresponsen van de menselijke huid mechanistisch te ontleden in een in vivo setting14. Succesvolle huid xenotransplantaties zijn afhankelijk van een geschikte voorbereiding van muizen en huidmonsters en muizen en naleving van aseptische knaagdierchirurgiemethoden15. Snelle koeling en goede opslag van huidmonsters bij koude temperaturen in media (zoals steriele zoutoplossing) zijn b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door gesponsorde onderzoeksovereenkomsten van TRex Bio en subsidies van de NIH (1R01AR075864-01A1). JMM wordt ondersteund door de Cancer Research Society (subsidie 26005). We erkennen de Parnassus Flow Cytometry Core die gedeeltelijk wordt ondersteund door subsidies NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 en S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
