Un ensemble de protocoles est présenté qui décrit la mesure de la fonction contractile via la détection de la longueur du sarcomère ainsi que la mesure transitoire du calcium (Ca2+) dans les myocytes isolés du rat. L’application de cette approche pour les études sur des modèles animaux d’insuffisance cardiaque est également incluse.
La dysfonction contractile et les transitoires Ca2+ sont souvent analysés au niveau cellulaire dans le cadre d’une évaluation complète des lésions cardiaques et / ou du remodelage. Une approche pour évaluer ces altérations fonctionnelles utilise le raccourcissement à vide et les analyses transitoires Ca2+ dans les myocytes cardiaques primaires adultes. Pour cette approche, les myocytes adultes sont isolés par digestion de collagénase, rendus tolérants au Ca2+ , puis collés à des lamelles de couverture recouvertes de laminine, suivies d’une stimulation électrique dans des milieux sans sérum. Le protocole général utilise des myocytes cardiaques de rat adulte, mais peut être facilement ajusté pour les myocytes primaires d’autres espèces. Les altérations fonctionnelles des myocytes des cœurs blessés peuvent être comparées à des myocytes fictifs et/ou à des traitements thérapeutiques in vitro . La méthodologie comprend les éléments essentiels nécessaires à la stimulation des myocytes ainsi que la chambre cellulaire et les composants de la plate-forme. Le protocole détaillé de cette approche intègre les étapes de mesure du raccourcissement à vide par détection de longueur de sarcomère et des transitoires cellulaires Ca2+ mesurés avec l’indicateur ratiométrique Fura-2 AM, ainsi que pour l’analyse des données brutes.
L’analyse de la fonction de la pompe cardiaque nécessite souvent une gamme d’approches pour obtenir des informations adéquates, en particulier pour les modèles animaux d’insuffisance cardiaque (IC). L’échocardiographie ou les mesures hémodynamiques donnent un aperçu de la dysfonction cardiaque in vivo 1, tandis que les approches in vitro sont souvent utilisées pour déterminer si la dysfonction provient de changements dans le myofilament et / ou le transitoire Ca2+ responsable du couplage de l’excitation, ou le potentiel d’action, avec la fonction contractile (par exemple, couplage excitation-contraction [E-C]). Les approches in vitro offrent également l’occasion de dépister la réponse fonctionnelle aux neurohormones, aux altérations génétiques induites par les vecteurs, ainsi qu’aux agents thérapeutiques potentiels2 avant de poursuivre des stratégies de traitement in vivo coûteuses et/ou laborieuses.
Plusieurs approches sont disponibles pour étudier la fonction contractile in vitro, y compris les mesures de force dans les trabécules intactes3 ou les myocytes perméabilisés4, ainsi que le raccourcissement à vide et les transitoires Ca2+ dans les myocytes intacts en présence et en l’absence de HF 5,6. Chacune de ces approches se concentre sur la fonction contractile des myocytes cardiaques, qui est directement responsable de la fonction de la pompe cardiaque 2,7. Cependant, l’analyse de la contraction et du couplage E-C est le plus souvent effectuée en mesurant le raccourcissement de la longueur musculaire et les transitoires Ca 2+ dans les myocytes adultes isolés tolérants au Ca2+. Le laboratoire utilise un protocole publié détaillé pour isoler les myocytes des cœurs de rats pour cette étape8.
Le transitoire Ca2+ et les myofilaments contribuent au raccourcissement et à l’allongement des myocytes intacts et peuvent contribuer à la dysfonction contractile 2,7. Ainsi, cette approche est recommandée lorsque l’analyse fonctionnelle in vitro nécessite un myocyte intact contenant la machinerie de cycle Ca2+ plus les myofilaments. Par exemple, des myocytes isolés intacts sont souhaitables pour étudier la fonction contractile après modification du myofilament ou de la fonction de cycle Ca2+ par transfertde gène 9. De plus, une approche des myocytes intacts est suggérée pour analyser l’impact fonctionnel des neurohormones lors de l’étude de l’impact des voies de signalisation des seconds messagers en aval et/ou de la réponse aux agents thérapeutiques2. Une mesure alternative de la force dépendante de la charge dans les myocytes simples est le plus souvent effectuée après perméabilisation membranaire (ou écorchage) à basse température (≤15 °C) pour éliminer la contribution transitoire Ca2+ et se concentrer sur la fonction myofilamentaire10. La mesure de la force dépendante de la charge plus les transitoires Ca2+ dans les myocytes intacts est rare en grande partie en raison du défi complexe et technique de l’approche11, en particulier lorsque le débit plus élevé est nécessaire, par exemple pour mesurer les réponses à la signalisation neurohormonale ou comme dépistage d’agents thérapeutiques. L’analyse des trabécules cardiaques surmonte ces défis techniques, mais peut également être influencée par les non-myocytes, la fibrose et / ou le remodelage de la matrice extracellulaire2. Chacune des approches décrites ci-dessus nécessite une préparation contenant des myocytes adultes car les myocytes néonatals et les myocytes dérivés de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi) n’expriment pas encore le complément complet des protéines de myofilament adultes et n’ont généralement pas le niveau d’organisation du myofilament présent dans le myocyte2 adulte en forme de bâtonnet. À ce jour, les données probantes dans les CSPi indiquent que la transition complète vers les isoformes adultes dépasse plus de 134 jours en culture12.
Étant donné que cette collection met l’accent sur l’IC, les protocoles comprennent des approches et des analyses pour différencier la fonction contractile des myocytes intacts défaillants par rapport aux myocytes intacts non défaillants. Des exemples représentatifs sont fournis à partir de myocytes de rats étudiés 18 à 20 semaines après une coarctation suprarénale, décrite précédemment 5,13. Des comparaisons sont ensuite faites avec des myocytes de rats traités fictivement.
Le protocole et la plateforme d’imagerie décrits ici sont utilisés pour analyser et surveiller les changements dans le raccourcissement et les transitoires Ca2+ dans les myocytes cardiaques en forme de bâtonnets au cours du développement de l’IC. Pour cette analyse, 2 x 104 Ca 2+-tolérants, en forme de bâtonnet, sont plaqués sur des lamelles de verre laminées (CS) de22 mm 2 et cultivés pendant la nuit, comme décrit précédemment8. Les composants assemblés pour cette plate-forme d’imagerie, ainsi que les supports et les tampons utilisés pour une imagerie optimale, sont fournis dans le tableau des matériaux. Un guide pour l’analyse des données à l’aide d’un logiciel et les résultats représentatifs sont également fournis ici. Le protocole global est divisé en sous-sections distinctes, les trois premières sections se concentrant sur les myocytes isolés de rats et l’analyse des données, suivies des expériences transitoires Ca2+ cellulaires et de l’analyse des données dans les myocytes.
Le protocole de stimulation chronique décrit à l’étape 1 prolonge le temps utile pour étudier les myocytes isolés et évaluer l’impact de traitements plus longs. Dans notre laboratoire, des résultats cohérents ont été obtenus jusqu’à 4 jours après l’isolement lors de la mesure de la fonction contractile en utilisant la longueur du sarcomère sur des myocytes à rythme chronique. Cependant, la fonction contractile myocytaire se détériore rapidement lors de l’utilisation de milieux âgés de plus de …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par la subvention R01 HL144777 (MVW) des National Institutes of Health (NIH).
MEDIA | |||
Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
#1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |