Analyse de la dysfonction contractile cardiaque et des transitoires Ca2+ dans les myocytes de rongeurs

Summary

Un ensemble de protocoles est présenté qui décrit la mesure de la fonction contractile via la détection de la longueur du sarcomère ainsi que la mesure transitoire du calcium (Ca²⁺) dans les myocytes isolés du rat. L’application de cette approche pour les études sur des modèles animaux d’insuffisance cardiaque est également incluse.

Abstract

La dysfonction contractile et les transitoires Ca²⁺ sont souvent analysés au niveau cellulaire dans le cadre d’une évaluation complète des lésions cardiaques et / ou du remodelage. Une approche pour évaluer ces altérations fonctionnelles utilise le raccourcissement à vide et les analyses transitoires Ca²⁺ dans les myocytes cardiaques primaires adultes. Pour cette approche, les myocytes adultes sont isolés par digestion de collagénase, rendus tolérants au Ca²⁺ , puis collés à des lamelles de couverture recouvertes de laminine, suivies d’une stimulation électrique dans des milieux sans sérum. Le protocole général utilise des myocytes cardiaques de rat adulte, mais peut être facilement ajusté pour les myocytes primaires d’autres espèces. Les altérations fonctionnelles des myocytes des cœurs blessés peuvent être comparées à des myocytes fictifs et/ou à des traitements thérapeutiques in vitro . La méthodologie comprend les éléments essentiels nécessaires à la stimulation des myocytes ainsi que la chambre cellulaire et les composants de la plate-forme. Le protocole détaillé de cette approche intègre les étapes de mesure du raccourcissement à vide par détection de longueur de sarcomère et des transitoires cellulaires Ca²⁺ mesurés avec l’indicateur ratiométrique Fura-2 AM, ainsi que pour l’analyse des données brutes.

Introduction

L’analyse de la fonction de la pompe cardiaque nécessite souvent une gamme d’approches pour obtenir des informations adéquates, en particulier pour les modèles animaux d’insuffisance cardiaque (IC). L’échocardiographie ou les mesures hémodynamiques donnent un aperçu de la dysfonction cardiaque in vivo ¹, tandis que les approches in vitro sont souvent utilisées pour déterminer si la dysfonction provient de changements dans le myofilament et / ou le transitoire Ca²⁺ responsable du couplage de l’excitation, ou le potentiel d’action, avec la fonction contractile (par exemple, couplage excitation-contraction [E-C]). Les approches in vitro offrent également l’occasion de dépister la réponse fonctionnelle aux neurohormones, aux altérations génétiques induites par les vecteurs, ainsi qu’aux agents thérapeutiques potentiels² avant de poursuivre des stratégies de traitement in vivo coûteuses et/ou laborieuses.

Plusieurs approches sont disponibles pour étudier la fonction contractile in vitro, y compris les mesures de force dans les trabécules intactes³ ou les myocytes perméabilisés⁴, ainsi que le raccourcissement à vide et les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes intacts en présence et en l’absence de HF ^5,6. Chacune de ces approches se concentre sur la fonction contractile des myocytes cardiaques, qui est directement responsable de la fonction de la pompe cardiaque ^2,7. Cependant, l’analyse de la contraction et du couplage E-C est le plus souvent effectuée en mesurant le raccourcissement de la longueur musculaire et les transitoires Ca 2+ dans les myocytes adultes isolés tolérants au Ca²⁺. Le laboratoire utilise un protocole publié détaillé pour isoler les myocytes des cœurs de rats pour cette étape⁸.

Le transitoire Ca²⁺ et les myofilaments contribuent au raccourcissement et à l’allongement des myocytes intacts et peuvent contribuer à la dysfonction contractile ^2,7. Ainsi, cette approche est recommandée lorsque l’analyse fonctionnelle in vitro nécessite un myocyte intact contenant la machinerie de cycle Ca²⁺ plus les myofilaments. Par exemple, des myocytes isolés intacts sont souhaitables pour étudier la fonction contractile après modification du myofilament ou de la fonction de cycle Ca²⁺ par transfert^{de gène 9}. De plus, une approche des myocytes intacts est suggérée pour analyser l’impact fonctionnel des neurohormones lors de l’étude de l’impact des voies de signalisation des seconds messagers en aval et/ou de la réponse aux agents thérapeutiques². Une mesure alternative de la force dépendante de la charge dans les myocytes simples est le plus souvent effectuée après perméabilisation membranaire (ou écorchage) à basse température (≤15 °C) pour éliminer la contribution transitoire Ca²⁺ et se concentrer sur la fonction myofilamentaire¹⁰. La mesure de la force dépendante de la charge plus les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes intacts est rare en grande partie en raison du défi complexe et technique de l’approche¹¹, en particulier lorsque le débit plus élevé est nécessaire, par exemple pour mesurer les réponses à la signalisation neurohormonale ou comme dépistage d’agents thérapeutiques. L’analyse des trabécules cardiaques surmonte ces défis techniques, mais peut également être influencée par les non-myocytes, la fibrose et / ou le remodelage de la matrice extracellulaire². Chacune des approches décrites ci-dessus nécessite une préparation contenant des myocytes adultes car les myocytes néonatals et les myocytes dérivés de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi) n’expriment pas encore le complément complet des protéines de myofilament adultes et n’ont généralement pas le niveau d’organisation du myofilament présent dans le myocyte² adulte en forme de bâtonnet. À ce jour, les données probantes dans les CSPi indiquent que la transition complète vers les isoformes adultes dépasse plus de 134 jours en culture¹².

Étant donné que cette collection met l’accent sur l’IC, les protocoles comprennent des approches et des analyses pour différencier la fonction contractile des myocytes intacts défaillants par rapport aux myocytes intacts non défaillants. Des exemples représentatifs sont fournis à partir de myocytes de rats étudiés 18 à 20 semaines après une coarctation suprarénale, décrite précédemment ^5,13. Des comparaisons sont ensuite faites avec des myocytes de rats traités fictivement.

Le protocole et la plateforme d’imagerie décrits ici sont utilisés pour analyser et surveiller les changements dans le raccourcissement et les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes cardiaques en forme de bâtonnets au cours du développement de l’IC. Pour cette analyse, 2 x 10^{4 Ca} 2+-tolérants, en forme de bâtonnet, sont plaqués sur des lamelles de verre laminées (CS) de^{22 mm 2} et cultivés pendant la nuit, comme décrit précédemment⁸. Les composants assemblés pour cette plate-forme d’imagerie, ainsi que les supports et les tampons utilisés pour une imagerie optimale, sont fournis dans le tableau des matériaux. Un guide pour l’analyse des données à l’aide d’un logiciel et les résultats représentatifs sont également fournis ici. Le protocole global est divisé en sous-sections distinctes, les trois premières sections se concentrant sur les myocytes isolés de rats et l’analyse des données, suivies des expériences transitoires Ca²⁺ cellulaires et de l’analyse des données dans les myocytes.

Protocol

Les études réalisées sur les rongeurs ont suivi la politique du Service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Pour cette étude, des myocytes ont été isolés chez des rats Sprague-Dawley et F344BN âgés de 3 à 34 mois pesant ≥ 200 g5. Les taux des hommes et des femmes ont été utilisés. <p class="jove_tit…

Representative Results

Les études de la fonction contractile sont effectuées sur les myocytes de rat à partir du lendemain de l’isolement (jour 2) jusqu’à 4 jours après l’isolement. Bien que les myocytes puissent être enregistrés le lendemain de l’isolement (c.-à-d. le jour 2), des temps de culture plus longs sont souvent nécessaires après le transfert de gènes ou les traitements pour modifier la fonction contractile8. Pour les myocytes cultivés pendant plus de 18 heures après l’isolement, le prot…

Discussion

Le protocole de stimulation chronique décrit à l’étape 1 prolonge le temps utile pour étudier les myocytes isolés et évaluer l’impact de traitements plus longs. Dans notre laboratoire, des résultats cohérents ont été obtenus jusqu’à 4 jours après l’isolement lors de la mesure de la fonction contractile en utilisant la longueur du sarcomère sur des myocytes à rythme chronique. Cependant, la fonction contractile myocytaire se détériore rapidement lors de l’utilisation de milieux âgés de plus de …

Materials

MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps – Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: — Photon counting system            –  Xenon power supply with dual excitation light source            –  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 – The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps – Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing – E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90	Panel A #11