使用MRI，组织清除和光片显微镜对完整的新生小鼠大脑进行全脑单细胞成像和分析
Summary
该协议描述了使用iDISCO +对完整小鼠大脑进行磁共振成像，清除和免疫标记的方法，然后详细说明了使用光片显微镜成像和使用NuMorph的下游分析。
Abstract
组织清除后进行光片显微镜（LSFM）能够对完整的大脑结构进行细胞分辨率成像，从而可以定量分析由遗传或环境扰动引起的结构变化。全脑成像可以更准确地定量细胞，并研究物理切片组织的常用显微镜可能遗漏的区域特异性差异。与共聚焦显微镜相比，使用光片显微镜对清除的大脑进行成像大大提高了采集速度。尽管这些图像产生非常大量的大脑结构数据，但大多数在清除组织图像中进行特征量化的计算工具仅限于计数稀疏的细胞群，而不是所有细胞核。
在这里，我们展示了NuMorph（基于核的形态测量），一组分析工具，用于量化出生后第4天（P4）小鼠大脑注释区域内的所有细胞核和核标记物，在光片显微镜上清除和成像。我们描述了磁共振成像（MRI），以在组织清除脱水步骤引起的收缩之前测量脑体积，使用iDISCO+方法清除组织，包括免疫标记，然后使用市售平台进行光片显微镜，以细胞分辨率对小鼠大脑进行成像。然后，我们使用NuMorph演示了这个图像分析管道，该管道用于校正强度差异，拼接图像图块，对齐多个通道，计数细胞核，并通过注册到公开可用的图谱来注释大脑区域。
我们使用公开可用的协议和软件设计了这种方法，允许任何具有必要显微镜和计算资源的研究人员执行这些技术。这些组织清除、成像和计算工具允许测量和量化皮层中细胞类型的三维 （3D） 组织，应广泛适用于任何野生型/敲除小鼠研究设计。
Introduction
单细胞分辨率的全脑成像是神经科学中的一个重要挑战。细胞分辨率脑图像允许对脑回路进行详细分析和系统级映射，以及该回路如何被神经精神疾病的遗传或环境风险因素、发育中的胚胎中的细胞行为以及成人大脑中的神经回路破坏1，2，3。有多种组织学方法可以对重建的3D大脑进行高分辨率图像;然而，这些技术需要昂贵的专用设备，可能与免疫标记不兼容，并且某些方法的二维（2D）性质可能导致切片过程中的组织损伤和剪切4，5。
最近的进展提供了一种不需要组织切片的整个大脑成像的替代方法;它们涉及使用组织清除使大脑透明。在大多数组织清除方法中，通过去除脂质（因为它们是光散射的主要来源）以及在成像过程中将物体的折射率（RI）与样品浸没溶液的折射率（RI）相匹配来实现透明度。然后光可以穿过材料之间的边界而不会被散射6，7，8，9。
组织清除方法，如iDISCO+，通常与使用单光子激发显微镜的快速3D成像相结合，如LSFM6，7，10。在用荧光团标记的透明组织内，光片荧光显微镜通过用薄平面的光11激发对切片进行成像。LSFM的主要优点是一次照亮单个光学切片，该切片内分子的所有荧光都被激发，从而最大限度地减少了光漂白。此外，对整个光学切片进行成像可以基于相机检测激发切片，从而相对于点扫描12提高速度。LSFM无损地生产适合3D重建的配准良好的光学切片。
虽然iDISCO+方法允许在~3周内进行廉价的组织清除，但方案中的脱水步骤可能导致组织收缩和样品形态的潜在改变，从而影响体积测量6，10。在组织清除程序之前添加二次成像方法，例如MRI，可以测量整个样品的组织清除引起的收缩程度。在脱水步骤中，灰质和白质之间的机械性能差异可能导致脑物质变形不均匀，导致野生型和突变型样品之间不同的组织清除诱导的体积变形，并可能混淆对这些样品中体积差异的解释10，13.MRI是通过首先用造影剂（例如钆）灌注动物来进行的，然后在成像14之前将提取的目标组织在浸没溶液（例如fomblin）中孵育。MRI与组织清除和对同一样品进行LSFM兼容。
LSFM通常用于创建大规模显微镜图像，用于目标脑组织的定性可视化，而不是对脑结构进行定量评估（图1）。如果没有定量评估，就很难证明遗传或环境损害造成的结构差异。随着组织清除和成像技术的改进，以及存储和计算能力成本的降低，量化感兴趣组织内的细胞类型定位变得越来越容易，使更多的研究人员能够将这些数据纳入他们的研究中。
随着小鼠大脑中超过 1 亿个细胞15 和可以生成 TB 数据的全脑成像会话，对高级图像分析工具的需求不断增加，这些工具可以准确量化图像中的特征，例如细胞。对于组织清除图像存在许多分割方法，这些方法对核染色强度应用阈值并过滤具有预定义形状，大小或密度10，16，17，18的物体。然而，对结果的不准确解释可能是由于细胞大小、图像对比度和标记强度等参数的变化引起的。本文描述了我们建立的量化小鼠大脑细胞核的方案。首先，我们详细介绍了P4小鼠大脑组织收集的步骤，然后是根据公开可用的iDISCO+方法10优化的组织清除和免疫标记方案。其次，我们描述了使用MRI和光片显微镜进行的图像采集，包括用于捕获图像的参数。最后，我们描述并演示了NuMorph19，这是我们小组开发的一组图像分析工具，可以在组织清除后进行细胞类型特异性定量，使用核标记进行免疫标记以及注释区域的光片成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
组织清除方法是测量大脑3D细胞组织的有用技术。文献中描述了许多组织清除方法，每种方法都有其优点和局限性6，7，8，9。用于分析组织清除图像中细胞类型的计算工具的选项相对有限。其他可用的工具已经实施到稀疏细胞群，其中分割难度较低10，35或?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH（R01MH121433，R01MH118349和R01MH120125到JLS和R01NS110791到GW）和希望基金会的支持。我们感谢显微镜服务实验室的Pablo Ariel协助样品成像。病理学和检验医学系的显微镜服务实验室得到了癌症中心核心支持拨款P30 CA016086对北卡罗来纳大学（UNC）Lineberger综合癌症中心的部分支持。神经科学显微镜核心由拨款P30 NS045892支持。本出版物中报告的研究部分得到了北卡罗来纳州生物技术中心机构支持补助金2016-IDG-1016的支持。
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
References
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
- Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
- Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
- Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
- Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
- Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
- Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
- Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
- Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
- Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
- . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
- Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
- . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
- Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
- Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
- Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
- Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
- Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
- Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
- Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
- Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
- Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
- Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
