Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique
Summary
Ici, nous avons développé un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour reproduire la souche biomécanique in vivo des cellules musculaires lisses dans la paroi aortique humaine.
Abstract
Des techniques conventionnelles de culture cellulaire bidimensionnelle et des modèles animaux ont été utilisés dans l’étude de l’anévrisme et de la dissection de l’aorte thoracique humaine (TAAD). Cependant, le TAAD humain ne peut parfois pas être caractérisé par des modèles animaux. Il existe un écart apparent entre les études cliniques sur les humains et les expériences sur les animaux qui peut entraver la découverte de médicaments thérapeutiques. En revanche, le modèle de culture cellulaire conventionnel est incapable de simuler des stimuli biomécaniques in vivo . À cette fin, les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui reproduisent le microenvironnement biomécanique. Dans cette étude, un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-on-a-Chip) a été développé pour simuler les paramètres physiopathologiques de la biomécanique aortique, y compris l’amplitude et la fréquence de la déformation cyclique subie par les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) qui jouent un rôle vital dans TAAD. Dans ce modèle, la morphologie des HASMC est devenue allongée, alignée perpendiculairement à la direction de la déformation et présentait un phénotype plus contractile dans des conditions de déformation que dans des conditions conventionnelles statiques. Cela était cohérent avec l’orientation cellulaire et le phénotype dans les parois aortiques humaines natives. De plus, en utilisant des TAAD liés à la valve aortique bicuspide (BAV-TAAD) et des HASMC primaires dérivés des patients liés à la valve aortique tricuspide (TAV-TAAD), nous avons établi des modèles de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD, qui reproduisent les caractéristiques HASMC dans TAAD. Le modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro complémentaire aux modèles animaux pour explorer davantage la pathogenèse du TAAD et découvrir des cibles thérapeutiques.
Introduction
L’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique (TAAD) sont une dilatation ou une délamination localisée de la paroi aortique associée à une morbidité et une mortalité élevées1. Les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du TAAD. Les HASMC ne sont pas des cellules différenciées en phase terminale, et les HASMC conservent une plasticité élevée, ce qui leur permet de changer de phénotype en réponse à différents stimuli2. Les HASMC sont principalement soumis à une contrainte de traction rythmique in vivo, et c’est l’un des facteurs clés régulant les changements morphologiques des muscles lisses, la différenciation et les fonctions physiologiques 3,4. Par conséquent, le rôle de la déformation cyclique dans l’étude des HASMC ne peut être ignoré. Cependant, les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne peuvent pas reproduire la stimulation biomécanique de la souche cyclique subie par les HASMC in vivo. De plus, la construction d’un modèle TAAD animal ne convient pas à certains types de TAAD, tels que le TAAD lié à la valve aortique bicuspide (BAV). De plus, l’écart entre les études cliniques sur l’homme et l’expérimentation animale ne peut être ignoré. Elle entrave la traduction pharmaceutique dans la pratique clinique. Ainsi, il existe un besoin urgent de systèmes physiologiques plus complexes pour simuler l’environnement biomécanique in vivo dans la recherche sur les maladies de l’aorte.
Les expériences sur les animaux utilisées dans la recherche biomédicale et le développement de médicaments sont coûteuses, longues et éthiquement discutables. En outre, les résultats des études animales ne permettent souvent pas de prédire les résultats obtenus dans les essais cliniques chez l’homme 5,6. L’absence de modèles précliniques humains et le taux élevé d’échec dans les essais cliniques ont entraîné peu de médicaments efficaces pour la clinique, ce qui a augmenté les coûts des soins de santé7. Il est donc urgent de trouver d’autres modèles expérimentaux pour compléter les modèles animaux. Les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui remédient aux inconvénients des techniques traditionnelles de culture cellulaire 2D et établissent un modèle in vitro plus réaliste, peu coûteux et efficace pour les études physiologiques et le développement de médicaments. À l’aide de dispositifs microfluidiques, des organes sur puce sont établis pour cultiver des cellules vivantes dans des chambres de taille micrométrique avec différents stimuli pour reproduire les fonctions clés d’un tissu ou d’un organe. Le système se compose d’un ou de plusieurs microcanaux microfluidiques, avec soit un type de cellule cultivée dans une chambre perfusée répliquant des fonctions d’un type de tissu, soit différents types de cellules cultivées sur des membranes poreuses pour recréer des interfaces entre différents tissus. Les organoïdes microfluidiques combinés à des cellules dérivées de patients ont l’avantage unique de combler la grande différence d’espèces entre les modèles de maladies de souris et d’humains et de surmonter les inconvénients de la culture cellulaire 2D traditionnelle pour la recherche sur le mécanisme de la maladie et la découverte de médicaments. Avec le développement rapide de la microfluidique au cours des dernières années, les chercheurs ont réalisé l’utilité des modèles in vitro d’organes sur puce (OOC) répliquant des paramètres biologiques complexes in vivo 8. Ces organoïdes microfluidiques simulent des environnements biomécaniques in vitro, tels que la déformation cyclique, la contrainte de cisaillement et la pression du liquide, fournissant un environnement de culture cellulaire tridimensionnel (3D). À ce jour, plusieurs modèles OOC ont été établis pour simuler des stimuli biomécaniques dans des organes tels que le poumon9, le rein 10, le foie11, l’intestin 12 et le cœur 13, mais ceux-ci n’ont pas été largement appliqués à l’étude de la maladie aortique humaine.
Dans cette étude, nous présentons un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ On-A-Chip) qui peut contrôler les forces et les rythmes mécaniques biomimétiques appliqués aux HASMC primaires dérivés du patient TAAD. La puce se compose de plaques épaisses à trois couches de polydiméthylsiloxane (PDMS) gravées avec des canaux et de deux membranes PDMS hautement flexibles commercialisées. Les HASMC sont cultivés sur les membranes PDMS. Le canal au milieu de la puce est rempli d’un milieu de culture pour la culture cellulaire. Les canaux supérieur et inférieur de la puce sont connectés à un système d’alimentation en pression sous vide qui peut contrôler le rythme et la fréquence de la déformation mécanique de traction des membranes PDMS. La contrainte rythmique subie par les HASMC peut être simulée dans HASMC-OOC, reproduisant le microenvironnement biomécanique des tissus ou des organes qui n’est pas fonctionnellement réalisable avec les systèmes de culture 2D conventionnels. Avec l’avantage de l’imagerie en temps réel à haute résolution et du microenvironnement biomécanique, les activités biochimiques, génétiques et métaboliques des cellules vivantes peuvent être étudiées pour le développement tissulaire, la physiologie des organes, l’étiologie de la maladie, les mécanismes moléculaires et l’identification des biomarqueurs, les maladies cardiovasculaires et les maladies aortiques. Combiné avec des cellules spécifiques aux tissus et aux patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments, la médecine personnalisée et les tests de toxicité. Ce modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro pour étudier la pathogenèse de la maladie aortique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec le développement rapide de la technologie microfluidique, des modèles OOC capables de reproduire la fonction biologique et la structure d’un ou plusieurs organes in vitro ont émergé ces dernières années pour des applications en biologie, médecine et pharmacologie15. OOC peut simuler des fonctions clés du microenvironnement physiologique humain, essentiel pour explorer les mécanismes de la maladie et promouvoir la traduction précliniquedes médicaments</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent que ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (20ZR1411700), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81771971) et du programme de voile de Shanghai (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
