Summary

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

Published: December 09, 2022
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Summary

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による キナーゼ調節部位Thr906/1007でのKCC2リン酸化の調査について説明しています。また、KCC2活性を確認するための追加の方法は、このテキストで簡単に強調されています。

Abstract

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl 恒常性の適切な機能とその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です。KCC2の適切な調節の失敗は有害であり、てんかんを含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関してはかなりの進歩があり、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定されています。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここでは、キナーゼ調節部位(Thr906およびThr1007)でのKCC2リン酸化をウェスタンブロッティング技術を使用して調べる方法を強調しています。ルビジウムイオンやタリウムイオン取り込みアッセイなど、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。これらの追加のテクニックのいくつかについては、この原稿で簡単に説明します。

Introduction

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl恒常性の適切な機能、およびその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です1,2,3,4KCC2による4-6 mMの低神経内Cl-濃度([Cl]i)の維持は、脳および脊髄におけるγ-アミノ酪酸(GABA)/グリシンの過分極およびシナプス阻害を促進する5。KCC2の適切な調節の失敗は、てんかん4を含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。さらに、KCC2を介したCl押し出しの減少、および過分極GABAAおよび/またはグリシン受容体媒介電流の障害は、てんかん、神経因性疼痛、および痙縮に関係しています6,7ニューロンKCC2は、リジンなし(WNK)-STE20/SPS1関連プロリン/アラニンリッチ(SPAK)/酸化ストレス応答性(OSR)キナーゼシグナル伝達複合体1によるC末端細胞内ドメイン内の主要な調節残基のリン酸化を介して負に調節され、未熟ニューロンにおける脱分極GABA活性の維持を促進します2,8,9.WNK-SPAK/OSR1は、スレオニン残基906および1007(Thr906/Thr1007)をリン酸化し、続いてKCC2のmRNA遺伝子発現を下方制御し、その結果、その生理学的機能を低下させます8,10。しかし、さらに重要なことに、WNK-SPAK/OSR1キナーゼ複合体がKCC2発現をリン酸化および阻害することが知られており1,2,4,11,12、およびThr906/Thr1007をリン酸化するキナーゼ複合体シグナル伝達経路の阻害がKCC2 mRNA遺伝子の発現増加と関連していることはすでに事実です13,14,15.タンパク質リン酸化を介したニューロンKCC2およびNa+-K+-2Cl共輸送体1(NKCC1)発現の調節は、同時に、逆のパターンで機能することに注意することが重要です1,4,16

KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関しては、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定された、一貫したかなりの進歩がありました。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここで紹介するプロトコルは、キナーゼ調節部位Thr906/1007での共輸送体のリン酸化を調べることにより、ニューロンK+-Cl 共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の応用を強調しています

ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC1 のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC3 Thr991/Thr1048リン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤を同定するために使用されています17。このプロトコルに従うことにより、細胞/組織溶解物から総リン酸化KCC2を特異的に検出することができます。原理的には、本手法によるタンパク質結合抗体の検出は、KCC2のリン酸化部位における協同活性の理解に役立ち、その生理制御に関わる分子機構の解明に大いに役立ちます。全タンパク質発現の定量分析は、KCC2の機能と活性を代表するものです。KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法、例えばルビジウムイオンおよびタリウムイオン取り込みアッセイがある。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。

Protocol

注:このプロトコルでは、目的の特定のタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング法について説明しています。 1. 細胞培養とトランスフェクション 細胞培養手順の前に、すべての試薬をビーズバス(37°C)で温めます。10%ウシ胎児血清、各1%2mM L-グルタミン1%、非必須アミノ酸100x、ピルビン酸ナトリウム100 mM、およびペニシリン-ストレプト?…

Representative Results

ここでは、図1に示す代表的な結果を、ウェスタンブロッティング技術を用いて、KCC2b(HEK rnKCC2b)18を安定発現するHEK293細胞株におけるWNK-SPAK/OSR1を介したKCC2およびNKCC1のリン酸化に対するスタウロスポリンおよびNEMの影響を調査した。代表的な結果に関する包括的な詳細は、Zhang et al.15で議論されている。NEMと同様に、ス?…

Discussion

KCC2を含むニューロンで発現されるCCCのSLC12の活性を測定するために多くの方法が用いられてきた。これらの技術の多くは、これらのトランスポーターの機能的関連性と、さまざまな疾患関連変異におけるそれらの構造機能パターンの分析に関する科学的知識を強化することが証明されています。重要なことに、さまざまな方法21には利点と注意点があります。しかし、上記?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、英国王立協会(助成金番号IEC\NSFC\201094)、および連邦博士号奨学金によってサポートされました。

Materials

40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

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