Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Summary

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. La maggior parte dei modelli murini di metastasi cerebrali sono complicati da metastasi sistemiche che confondono l’analisi della mortalità e dei risultati dell’intervento terapeutico. Presentato qui è un protocollo per l’iniezione carotidea interna di cellule tumorali che produce tumori intracranici coerenti con tumori sistemici minimi.

Abstract

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. Gli aspetti critici delle malattie metastatiche, come il complesso microambiente neurale e l’interazione delle cellule stromali, non possono essere completamente replicati con saggi in vitro ; Pertanto, i modelli animali sono fondamentali per studiare e comprendere gli effetti dell’intervento terapeutico. Tuttavia, la maggior parte dei metodi di xenotrapianto di tumori cerebrali non produce metastasi cerebrali in modo coerente in termini di lasso di tempo e carico tumorale. I modelli di metastasi cerebrali generati dall’iniezione intracardiaca di cellule tumorali possono provocare un carico tumorale extracranico non intenzionale e portare a morbilità e mortalità metastatiche non cerebrali. Sebbene l’iniezione intracranica di cellule tumorali possa limitare la formazione di tumori extracranici, ha diversi avvertimenti, come le cellule iniettate spesso formano una singola massa tumorale nel sito di iniezione, un elevato coinvolgimento leptomeningeo e danni alla vascolarizzazione cerebrale durante la penetrazione dell’ago. Questo protocollo descrive un modello murino di metastasi cerebrali generate dall’iniezione interna dell’arteria carotide. Questo metodo produce tumori intracranici in modo coerente senza il coinvolgimento di altri organi, consentendo la valutazione di agenti terapeutici per le metastasi cerebrali.

Introduction

Le metastasi cerebrali sono un tumore maligno prevalente associato a una prognosi molto sfavorevole ^1,2. Lo standard di cura per i pazienti sottoposti a metastasi cerebrali è multimodale, costituito da neurochirurgia, radioterapia cerebrale completa e/o radiochirurgia stereotassica a seconda dello stato di salute generale dei pazienti, del carico di malattia extracranica e del numero e della posizione dei tumori nel cervello ^3,4. I pazienti con un massimo di tre lesioni intracraniche sono eleggibili per la resezione chirurgica o la radiochirurgia stereotassica, mentre la radioterapia dell’intero cervello è raccomandata per i pazienti con lesioni multiple per evitare il rischio di infezione correlata alla chirurgia ed edema⁵. Tuttavia, la radioterapia dell’intero cervello può infliggere danni alle strutture cerebrali radiosensibili, contribuendo alla scarsa qualità della vita⁶.

La terapia sistemica è un approccio logico alternativo e non invasivo per il trattamento di pazienti con lesioni multiple⁷. Tuttavia, è meno considerato a causa della nozione di lunga data che le terapie sistemiche hanno scarsa efficacia perché la somministrazione passiva di farmaci citotossici attraverso il flusso sanguigno non può raggiungere livelli terapeutici nel cervello senza il rischio di tossicità pericolosa⁸. Questo paradigma sta iniziando a cambiare con la terapia sistemica recentemente approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (tucatinib con trastuzumab e capecitabina indicato per metastasi cerebrali del carcinoma mammario HER2+)9,10,11,12 e l’aggiornamento delle linee guida per il trattamento per includere la considerazione delle opzioni di terapia sistemica per i pazienti con metastasi cerebrali^13,14.

In questo contesto, gli sviluppi nel campo della terapia molecolare mirata, dell’immunoterapia e dei sistemi alternativi di somministrazione di farmaci, come un vettore di nanofarmaci mirato, possono potenzialmente superare le sfide del trattamento delle metastasi cerebrali^15,16,17,18. Inoltre, sono in fase di studio anche approcci chimici e meccanici per migliorare la somministrazione di farmaci attraverso la permeabilizzazione della barriera cervello-tumore^19,20. Per studiare e ottimizzare tali approcci in modo che siano adatti allo scopo, è fondamentale utilizzare modelli preclinici che non solo rispecchino la complessa fisiologia delle metastasi cerebrali, ma consentano anche un’analisi obiettiva della risposta intracranica ai farmaci.

In generale, gli attuali approcci per modellare le metastasi cerebrali in vivo coinvolgono l’iniezione intracardiaca (ventricolo sinistro), endovenosa (di solito vena della coda), intracranica o intracarotidea (arteria carotide comune) di cellule tumorali nei topi 21,22,23,24,25,26,27 . Oltre alle strategie di attecchimento tumorale, i modelli murini geneticamente modificati in cui la formazione del tumore è innescata dalla rimozione dei geni oncosoppressori o dall’attivazione di oncogeni sono utili per la modellazione del tumore. Tuttavia, solo pochi modelli murini geneticamente modificati sono segnalati per produrre tumori secondari e ancora meno che producono in modo affidabile metastasi cerebrali^28,29,30.

I metodi di attecchimento come l’iniezione intracardiaca (ventricolo sinistro) e endovenosa (di solito vena della coda) imitano la diffusione sistemica del cancro. Questi modelli producono tipicamente lesioni in più organi (ad esempio, cervello, polmoni, fegato, reni, milza) a seconda del letto capillare che intrappola la maggior parte delle cellule tumorali durante il loro “primo passaggio” circolatorio31. Tuttavia, tassi incoerenti di attecchimento cerebrale richiederanno più animali per raggiungere la dimensione del campione per la potenza statistica desiderata. Il numero di cellule tumorali che alla fine si stabiliscono nel cervello attraverso questi metodi di iniezione intracardiaca e endovenosa è variabile. Quindi, il carico tumorale delle metastasi cerebrali può variare tra gli animali e la differenza di progressione può rendere difficile standardizzare la tempistica sperimentale e l’interpretazione dei risultati. Il carico tumorale extracranico può portare alla mortalità per metastasi non cerebrali, rendendo questi modelli inadatti per valutare l’efficacia intracranica. Le linee cellulari cervello-tropico sono state stabilite utilizzando processi artificiali di selezione clonale per ridurre l’insediamento extracranico, ma i tassi di assunzione sono stati incoerenti e il processo di selezione clonale può ridurre l’eterogeneità normalmente riscontrata nei tumori umani³².

I metodi di attecchimento specifici del cervello come l’iniezione intracranica e intracarotidea consentono una modellazione delle metastasi cerebrali più coerente ed efficiente. Nel metodo intracranico³³, le cellule tumorali vengono tipicamente iniettate nella corteccia cerebrale frontale, che genera una crescita tumorale rapida e riproducibile con un basso coinvolgimento sistemico. Mentre la procedura è ben tollerata con bassa mortalità³³, le avvertenze sono che si tratta di un approccio relativamente grezzo che introduce rapidamente un bolo (localizzato) di cellule nel cervello e non modella la patogenesi precoce delle metastasi cerebrali. L’ago danneggia la vascolarizzazione del tessuto cerebrale, che quindi causa infiammazione localizzata ^5,34. Dall’esperienza, c’è una tendenza per l’iniezione di cellule tumorali al reflusso durante la rimozione dell’ago, portando al coinvolgimento leptomeningeo. In alternativa, il metodo intracarotideo trasporta le cellule nell’arteria carotide comune con microvascolarizzazione cerebrale come primo letto capillare da incontrare, modellando la sopravvivenza in circolazione, stravaso e colonizzazione²⁴. In accordo con altri²⁵, la nostra esperienza con questo metodo ha scoperto che può provocare tumori facciali a causa della consegna involontaria di cellule tumorali attraverso l’arteria carotide esterna ai letti capillari in questi tessuti (dati non pubblicati). È possibile prevenire i tumori facciali legando prima l’arteria carotide esterna prima dell’iniezione comune dell’arteria carotide (Figura 1). Nel resto dell’articolo, questo metodo è indicato come “iniezione interna di arteria carotide”. Per esperienza, il metodo di iniezione dell’arteria carotidea interna genera costantemente metastasi cerebrali con pochissimi eventi sistemici e ha avuto successo nel generare modelli di metastasi cerebrali di diversi tumori primari (ad esempio, melanoma, mammella e tumori polmonari) (Figura 1). Gli svantaggi sono che è tecnicamente impegnativo, richiede tempo, invasivo e richiede un’attenta ottimizzazione del numero di celle e una tempistica di monitoraggio. In sintesi, entrambi i metodi di iniezione intracranica e interna dell’arteria carotide producono modelli murini adatti a valutare l’impatto terapeutico sul beneficio di sopravvivenza correlato al tumore cerebrale.

Questo protocollo descrive il metodo di iniezione dell’arteria carotide interna per produrre un modello murino di metastasi cerebrali con quasi nessun coinvolgimento sistemico e quindi adatto per la valutazione preclinica della distribuzione dei farmaci e dell’efficacia delle terapie sperimentali.

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di iniezione dell’arteria carotide interna per le metastasi cerebrali. L’iniezione interna dell’arteria carotide con legatura esterna dell’arteria carotide può produrre in modo affidabile un modello di metastasi cerebrale da vari tumori primari. In questo protocollo, tre legature sono posizionate sull’arteria carotide (annotate come L1-L3 nella figura). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

Tutti gli studi sono stati condotti all’interno delle linee guida del Comitato etico animale dell’Università del Queensland (UQCCR / 186 / 19) e del Codice australiano per la cura e l’uso degli animali per scopi scientifici. 1. Preparazione di cellule tumorali per iniezione NOTA: In questo studio, è stata utilizzata la linea cellulare di cancro al seno umano, BT-474 (BT474). BT474 è stato coltivato in un terreno di coltura completo comprendente RPM…

Representative Results

Confronto tra l’iniezione dell’arteria carotide comune con o senza legatura esterna dell’arteria carotideQuando le cellule tumorali sono state iniettate attraverso l’arteria carotide comune senza prima legare l’arteria carotide esterna24, i tumori facciali sono stati trovati nel 77,8% dei topi trapiantati (n = 7/9 animali). Un esempio di tumore facciale è illustrato nella Figura supplementare 3. Il metodo descritto in questo protocollo previ…

Discussion

Le metastasi cerebrali sono un processo complesso di cellule tumorali che si diffondono dal loro sito primario al cervello. Sono disponibili diversi modelli animali che rispecchiano alcune fasi di questo processo a più fasi e ci sono considerazioni fisiologiche e pratiche per la progettazione di studi preclinici sulle metastasi^41,42. La maggior parte degli studi pubblicati che studiano l’uso della nanomedicina per il trattamento delle metastasi cerebrali hanno u…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010