Summary
मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के सिकुड़ा हुआ कार्य और सेलुलर अखंडता में परिवर्तन का विश्लेषण गैर-नैदानिक दवा विकास के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है। एक हाइब्रिड 96-वेल सेल विश्लेषण प्रणाली विश्वसनीय, मानव-प्रासंगिक परिणामों के लिए वास्तविक समय और शारीरिक तरीके से दोनों मापदंडों को संबोधित करती है, जो नैदानिक चरणों में एक सुरक्षित संक्रमण के लिए आवश्यक है।
Abstract
नए चिकित्सीय के विकास और नैदानिक चरणों में उनके सुरक्षित संक्रमण के लिए कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मूल्यांकन का अत्यधिक महत्व है। जबकि मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा की खोज और सुरक्षा फार्माकोलॉजी के प्रीक्लिनिकल चरणों में मानव-प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा करने का वादा करते हैं, उनकी परिपक्वता अभी भी वैज्ञानिक समुदाय में विवादास्पद है और निरंतर विकास के अधीन है। हम एक हाइब्रिड कॉन्ट्रैक्टिलिटी और प्रतिबाधा / बाह्य क्षेत्र क्षमता (ईएफपी) तकनीक प्रस्तुत करते हैं, जो उद्योग-मानक 96-वेल प्लेटफॉर्म में महत्वपूर्ण प्रो-परिपक्वता सुविधाओं को जोड़ते हैं।
ईएफपी सिस्टम वास्तविक समय में सेलुलर कार्यक्षमता की निगरानी करता है। सिकुड़ा हुआ कोशिकाओं की बीट दर के अलावा, विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी रीडआउट सेल घनत्व और सेलुलर मोनोलेयर की अखंडता जैसे यौगिक-प्रेरित रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाता है। हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली के अन्य घटक में, कोशिकाओं को जैव-अनुरूप झिल्ली पर सुसंस्कृत किया जाता है जो वास्तविक हृदय ऊतक के यांत्रिक वातावरण की नकल करते हैं। यह शारीरिक वातावरण विट्रो में एचआईपीएससी-सीएम की परिपक्वता का समर्थन करता है, जिससे आइसोप्रोटेरनॉल, एस-बे के 8644, या ओमेकेमटिव मेकार्बिल के साथ उपचार के बाद सकारात्मक इनोट्रोपिक प्रभाव सहित अधिक वयस्क जैसी सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं होती हैं। संकुचन बल के आयाम (एमएन / मिमी2) और बीट अवधि जैसे पैरामीटर भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों और कैल्शियम हैंडलिंग पर प्रभाव के साथ यौगिकों के डाउनस्ट्रीम प्रभावों को प्रकट करते हैं।
हाइब्रिड सिस्टम समग्र सेल विश्लेषण के लिए आदर्श उपकरण प्रदान करता है, जिससे मानव-प्रासंगिक सेल-आधारित परख के वर्तमान दृष्टिकोण से परे प्रीक्लिनिकल कार्डियक जोखिम मूल्यांकन की अनुमति मिलती है।
Introduction
आधुनिक दवा विकास के प्रमुख लक्ष्यों में से एक दवा खोज पाइपलाइन में नए चिकित्सीय की बेंच-टू-बेडसाइड सफलता दर में सुधार है। इन नई दवाओं के सुरक्षा औषधीय परीक्षण से अक्सर कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम पर प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाओं का पता चलता है जो प्रीक्लिनिकल चरण1 में दवा एट्रिशन दर का लगभग एक-चौथाई हिस्सा है। नई दृष्टिकोण पद्धतियों (एनएएम) का विकास और एकीकरण प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के आधुनिकीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विशेष रूप से हृदय जैसे कोर बैटरी अंगों में। चूंकि ये पद्धतियां पशु-मुक्त दृष्टिकोण हैं, इसलिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मूल के कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) जैसे मानव-आधारित सेल मॉडल का उपयोग सुरक्षा औषधीय और विषविज्ञान के मुद्दों के आधुनिक मूल्यांकन के लिए पिछले दशक में वर्कहॉर्स बन गया। इस तरह की जांच के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली परख प्रणाली माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) और वोल्टेज-संवेदनशील डाई-आधारित प्रयोगात्मक दृष्टिकोणहैं।
फिर भी, इस सेल प्रकार की दावा की गई फेनोटाइपिक और कार्यात्मक अपरिपक्वता एक आदर्श मानव-आधारित सेल मॉडल के रास्ते में बाधाएं डालती है, जिसमें गैर-नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों के बीच ट्रांसलेशनल अंतराल को कम करने की क्षमताहोती है।
निहित अपरिपक्व फेनोटाइप के कारण को समझने और विट्रो में मानव आईपीएससी-सीएम की परिपक्वता प्रक्रिया को आगे बढ़ाने के तरीके खोजने के लिए वर्षों से जबरदस्त शोध किया गया है।
कार्डियक परिपक्वता संकेतों की कमी जैसे कि लंबे समय तक सेल संस्कृति समय, आसपास के क्षेत्र में अन्य सेल प्रकारों की अनुपस्थिति, या हार्मोनल उत्तेजना की कमी कोपरिपक्वता प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, नियमित सेल कल्चर प्लेटों के गैर-शारीरिक वातावरण को एक महत्वपूर्ण कारण के रूप में पहचाना गया था जो देशी मानव हृदय 5,6 की लापता शारीरिक सब्सट्रेट कठोरता के कारण मानव आईपीएससी-सीएम की परिपक्वताको बाधित करता है।
इस मुद्दे से निपटने के लिए देशी शारीरिक स्थितियों पर ध्यान देने के साथ विभिन्न परख प्रणालियों को विकसित किया गया था, जिसमें 3 डी सेल कल्चर सिस्टमशामिल हैं जहां कोशिकाओं को विशिष्ट दो-आयामी सेल संस्कृतियों के बजाय देशी कार्डियक आर्किटेक्चर के समान तीन-आयामी रूप से संरेखित किया जाता है। यद्यपि 3 डी परख के साथ बेहतर परिपक्वता प्राप्त की जाती है, एक कुशल कार्यबल की आवश्यकता और इन प्रणालियों के कम थ्रूपुट दवा विकास प्रक्रिया में इसके प्रचुर उपयोग में बाधा डालते हैं, क्योंकि समय और लागत वित्तीय स्तर 8 पर नए चिकित्सीय के मूल्यांकन में मौलिक भूमिकानिभाते हैं।
नए चिकित्सीय के सुरक्षा औषधीय और विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण रीडआउट मानव आईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक और संरचनात्मक विशेषताओं में परिवर्तन हैं, क्योंकि हृदय प्रणाली की यौगिक-प्रेरित प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाएं आमतौर पर इन गुणों में से एक या दोनों को प्रभावित करती हैं। इस तरह की व्यापक प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के प्रसिद्ध उदाहरण एंथ्रासाइक्लिन परिवार की कैंसर विरोधी दवाएं हैं। यहां, रोगियों में कैंसर के उपचार के दौरान और बाद में कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम पर खतरनाक कार्यात्मक और प्रतिकूल संरचनात्मक प्रभावों के साथ-साथ इन विट्रो सेल-आधारित परख10,11 के साथ व्यापक रूप से रिपोर्ट किए जाते हैं।
वर्तमान अध्ययन में, हम एचआईपीएससी-सीएम पर कार्यात्मक और संरचनात्मक यौगिक दुष्प्रभावों दोनों के आकलन के लिए एक व्यापक पद्धति का वर्णन करते हैं। कार्यप्रणाली में कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़ा हुआ बल और प्रतिबाधा / एक्स्ट्रासेल्युलर फील्ड पोटेंशियल (ईएफपी) विश्लेषण का विश्लेषण शामिल है। सिकुड़ा हुआ बल शारीरिक यांत्रिक परिस्थितियों में मापा जाता है, जिसमें कोशिकाओं को नरम (33 केपीए) सिलिकॉन सब्सट्रेट्स पर संवर्धित किया जाता है, जो देशी मानव हृदय ऊतक के यांत्रिक वातावरण को दर्शाता है।
यह प्रणाली प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा फार्माकोलॉजिकल और टॉक्सिकोलॉजिकल अध्ययनों के लिए मानव आईपीएससी-सीएम के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए 96-वेल प्लेटों से लैस है, और इस प्रकार वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले 3 डी दृष्टिकोण जैसे लैंगनडॉर्फ हार्ट या हार्ट स्लाइस12,13 के लिए एक लाभ प्रदान करता है।
विस्तार से, हाइब्रिड सिस्टम में दो मॉड्यूल होते हैं, या तो शारीरिक परिस्थितियों के तहत कार्डियक सिकुड़न के आकलन के लिए या वास्तविक समय सेलुलर संरचनात्मक विषाक्तता 6,14 के विश्लेषण के लिए। दोनों मॉड्यूल तेज और लागत प्रभावी डेटा अधिग्रहण के लिए विशेष उच्च थ्रूपुट 96-वेल प्लेटों के साथ काम करते हैं।
3 डी निर्माण की आवश्यकता के बिना, अनुबंध मॉड्यूल विशेष प्लेटों को नियोजित करता है जिसमें कठोर ग्लास या प्लास्टिक के बजाय कोशिकाओं के लिए सब्सट्रेट के रूप में लचीली सिलिकॉन झिल्ली होती है जो नियमित सेल कल्चर प्लेटों में आमतौर पर होती है। झिल्ली विशिष्ट मानव बायोमेकेनिकल हृदय गुणों को दर्शाती है और इसलिए उच्च थ्रूपुट तरीके से विवो स्थितियों में नकल करती है। जबकि मानव आईपीएससी-सीएम अक्सर अन्य सेल-आधारित परख14 में यौगिक-प्रेरित सकारात्मक इनोट्रॉपी के बारे में वयस्क कार्डियोमायोसाइट व्यवहार प्रदर्शित करने में विफल रहते हैं, जब कोशिकाओं को अनुबंध मॉड्यूल की प्लेटों पर सुसंस्कृत किया जाता है तो अधिक वयस्क जैसी प्रतिक्रिया का आकलन किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों में, यह प्रदर्शित किया गया है कि आईपीएससी-सीएम आइसोप्रोटेरनॉल, एस-बे के 8644, या ओमेकामटिव मेकार्बिल 6,15 जैसे यौगिकों के साथ उपचार पर सकारात्मक इनोट्रोपिक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। यहां, कई संकुचन मापदंडों का आकलन किया जा सकता है, जैसे कि संकुचन बल के आयाम (एमएन / मिमी2), बीट अवधि और बीट दर, साथ ही संकुचन चक्र के द्वितीयक पैरामीटर जैसे वक्र, संकुचन और विश्राम ढलानों के तहत क्षेत्र, बीट दर भिन्नताएं और अतालता (पूरक चित्र 1)16 . सभी मापदंडों में दवा-प्रेरित परिवर्तनों का मूल्यांकन कैपेसिटिव डिस्टेंस सेंसिंग द्वारा गैर-आक्रामक रूप से किया जाता है। कच्चे डेटा का विश्लेषण बाद में विशेष सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाता है।
संरचनात्मक विषाक्तता मॉड्यूल संरचनात्मक सेलुलर विषाक्तता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के विश्लेषण के लिए रीडआउट के रूप में अपनी अनूठी प्रतिबाधा और ईएफपी मापदंडों को जोड़ता है। विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक वास्तविक समय में निगरानी की गई सेल घनत्व या सेल और मोनोलेयर अखंडता में यौगिक-प्रेरित परिवर्तनों का खुलासा करती है, जैसा कि ज्ञात कार्डियोटॉक्सिकयौगिकों के साथ इलाज किए गए मानव आईपीएससी-सीएम के साथ दिखाया गया है। विभिन्न आवृत्तियों (1-100 kHz) पर प्रतिबाधा रीडआउट के साथ एक शारीरिक प्रतिक्रिया को आगे विच्छेदित करना संभव है, और इस प्रकार झिल्ली स्थलाकृति, सेल-सेल या सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों में परिवर्तन का खुलासा करना प्राप्त करने योग्य है। मानव आईपीएससी-सीएम की अतिरिक्त ईएफपी रिकॉर्डिंग आगे यौगिक उपचार द्वारा प्राप्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, जैसा कि सीआईपीए अध्ययन17,19 के प्रकाश में दिखाया गया था।
वर्तमान अध्ययन में, मानव आईपीएससी-सीएम को नियोजित किया गया था, एपिरुबिसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ इलाज किया गया था, दोनों को कार्डियोटॉक्सिक एंथ्रासाइक्लिन के रूप में अच्छी तरह से वर्णित किया गया था, और एर्लोटिनिब, एक टायरोसिन किनेज अवरोधक (टीकेआई) जिसमें कार्डियोवैस्कुलर विषाक्तता का खतरा कम था। एपिरुबिसिन, डॉक्सोर्यूबिसिन और एर्लोटिनिब के साथ क्रोनिक मूल्यांकन 5 दिनों के लिए किया गया था। परिणाम संकुचन और आधार प्रतिबाधा में मामूली बदलाव दिखाता है जब कोशिकाओं को एर्लोटिनिब के साथ इलाज किया गया था, लेकिन क्रमशः एपिरुबिसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ इलाज किए जाने पर संकुचन आयाम और आधार प्रतिबाधा में समय और खुराक-निर्भर विषाक्त कमी। तीव्र माप कैल्शियम चैनल ब्लॉकर निफेडिपिन के साथ किए गए थे और संकुचन आयाम, क्षेत्र संभावित अवधि और आधार प्रतिबाधा में कमी दिखाते हैं, कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तरों पर इस यौगिक के कार्डियोटॉक्सिक दुष्प्रभावों का प्रदर्शन करते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: अनुबंध और प्रतिबाधा / ईएफपी माप के लिए वर्कफ़्लो पूरक चित्र 2 में दिया गया है।
1. प्लेट कोटिंग
- वैक्यूम-सील पैकेजिंग खोलें और 96-वेल प्लेट को बाहर निकालें। दोनों मॉड्यूल की 96-वेल प्लेटों के लिए हैंडलिंग प्रक्रियाएं समान हैं। संकुचन प्लेट को अतिरिक्त रूप से आपूर्ति की गई झिल्ली गार्ड द्वारा कवर करें जब तक कि संकुचन मॉड्यूल में माप न हो।
- कार्डियोमायोसाइट्स को सीड करने के लिए लचीली 96-वेल प्लेटों को कोट करें।
- एक बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.75 एमएल ईएचएस जेल रेडी-टू-यूज़ घोल को स्थानांतरित करके एक पतला ईएचएस जेल कोटिंग समाधान तैयार करें। फिर सीए 2 +और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस के 8.25 एमएल जोड़ें। घोल को सावधानी से मिलाएं।
नोट: वैकल्पिक रूप से, फाइब्रोनेक्टिन का उपयोग कुओं को कोटिंग के लिए भी किया जा सकता है: सीए 2 +और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस के 13 एमएल में 650 μL फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान (1 μg / mL) को पतला करके एक बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 13 मिलीलीटर फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान तैयार करें, जिसके परिणामस्वरूप 50 μg / mL कार्यशील समाधान होता है। घोल को सावधानी से मिलाएं।
- एक बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.75 एमएल ईएचएस जेल रेडी-टू-यूज़ घोल को स्थानांतरित करके एक पतला ईएचएस जेल कोटिंग समाधान तैयार करें। फिर सीए 2 +और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस के 8.25 एमएल जोड़ें। घोल को सावधानी से मिलाएं।
- कोटिंग समाधान को प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट में रखे एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें।
- प्रोग्राम "ADD100μL" का उपयोग करके प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट के साथ प्रति अच्छी तरह से कोटिंग समाधान के 100 μL जोड़ें। ढक्कन को 96-वेल प्लेट पर वापस रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट के लिए कार्यक्रम को पहले से मैन्युअल रूप से पूर्वनिर्धारित करने की आवश्यकता है।
2. मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को लचीली 96-वेल प्लेटों में सीडिंग (दिन 0)
- निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को पिघलाएं।
- एक मैनुअल गिनती कक्ष के साथ कोशिकाओं की गणना करें और सेल निर्माता निर्देशों (जैसे, 1 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) के अनुसार अनुशंसित चढ़ाना माध्यम में कोशिकाओं को समायोजित करें, जिसके परिणामस्वरूप पूरे96-वेल प्लेट को सीड करने के लिए 11 x 10 6 कोशिकाएं /
- "रिमूव 100 μL" प्रोग्राम का उपयोग करके प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट के साथ कुओं से ईएचएस जेल समाधान निकालें। रोबोट से डिस्पेंसर कोटिंग समाधान युक्त अभिकर्मक जलाशय को हटा दें।
- सेल सस्पेंशन (कुल 11 एमएल) को लैब ऑटोमेशन रोबोट में रखे गए बाँझ अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें और प्रोग्राम "CELLS_ADD100 एल" का उपयोग करके कोशिकाओं को 100 μL / वेल के साथ बीज दें।
- सेल सीडिंग के तुरंत बाद, लचीली 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, आर्द्रता-नियंत्रित) में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को रात भर बसने दें।
3. लचीली 96-वेल प्लेटों का मध्यम आदान-प्रदान (दिन 1)
- प्लेटों को बीज देने के 18-24 घंटे बाद, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रति प्लेट कम से कम 22 एमएल कार्डियोमायोसाइट्स रखरखाव माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
- ताजा माध्यम (कम से कम 22 एमएल) को बाँझ अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें और इसे प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट के ठीक बगल में छोड़ दें। रोबोट में एक खाली अभिकर्मक जलाशय रखें और कार्यक्रम "रिमूव 100 μL" के साथ मध्यम निष्कासन करें। बाद में, अपशिष्ट माध्यम वाले अभिकर्मक जलाशय को ताजा माध्यम वाले अभिकर्मक जलाशय के साथ विनिमय करें और कार्यक्रम "ADD100μL" के साथ प्रति अच्छी तरह से ताजा माध्यम का 200 μL वितरित करें। 200 μL / अच्छी तरह से पहुंचने के लिए इस चरण को दो बार करें।
- मध्यम विनिमय के तुरंत बाद, प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
- यौगिक जोड़ तक हर दूसरे दिन एक मध्यम विनिमय (200 μL / अच्छी तरह से) करें।
4. यौगिक जोड़ने से पहले अंतिम मध्यम विनिमय (दिन 5-7)
- यौगिक जोड़ने से 4-6 घंटे पहले एक अंतिम मध्यम परिवर्तन करें।
- एक लचीली 96-वेल प्लेट के लिए कम से कम 22 एमएल परख बफर गर्म करें। परख बफर में रखरखाव माध्यम या डेरिवेटिव होते हैं (उदाहरण के लिए, कम / कोई सीरम मीडिया, फिनोल लाल मुक्त मीडिया, या अन्य आइसोटोनिक बफर)।
- ताजा माध्यम को बाँझ अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें और इसे प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट के ठीक बगल में छोड़ दें। रोबोट में एक खाली अभिकर्मक जलाशय रखें और मध्यम हटाने का प्रदर्शन करें। इसके बाद, अपशिष्ट माध्यम वाले अभिकर्मक जलाशय को ताजा माध्यम वाले अभिकर्मक जलाशय के साथ बदलें और ताजा माध्यम के 200 μL / कुएं को वितरित करें।
- मध्यम विनिमय के तुरंत बाद, लचीली प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
5. यौगिक जोड़ और डेटा रिकॉर्डिंग (दिन 5-7)
नोट: प्रयोग के लिए एक उदाहरण माप योजना पूरक चित्र 3 में दी गई है।
- बाँझ नियमित 96-गहरी वेल प्लेट का उपयोग करके लैमिनार प्रवाह हुड में 4x एकाग्रता पर प्रति यौगिक काम करने वाला समाधान तैयार करें। यौगिक समाधान चरण 4 में उपयोग किए जाने वाले परख बफर पर आधारित है। कम से कम 1 घंटे के लिए यौगिक समाधान युक्त 96-गहरी वेल प्लेट को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें ताकि इसे लचीली प्लेट के समान स्थिति में समायोजित किया जा सके।
नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक दवा की 1x एकाग्रता आंकड़ों और किंवदंतियों में प्रदान की जाती है। - बेसलाइन माप करने से पहले प्लेट को संबंधित माप डिवाइस में 1 घंटे स्थानांतरित करें।
- नियंत्रण सॉफ्टवेयर (हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली का हिस्सा) में संपादित प्रोटोकॉल खोलें और संबंधित माप मोड अनुबंध या प्रतिबाधा / ईएफपी का चयन करें।
- स्वीप अवधि (एक माप की लंबाई; उदाहरण के लिए, 30 सेकंड) और पुनरावृत्ति अंतराल (माप के बीच का समय; जैसे, 5 मिनट) को परिभाषित करें और प्रोटोकॉल संख्या को सहेजें।
- प्रारंभ प्रोटोकॉल का चयन करें > जारी रखें और अनुरोधित फ़ील्ड भरें।
- अंत में, प्रारंभ माप का चयन करें। यौगिक जोड़ने से कुछ समय पहले 5 मिनट के अंतराल में न्यूनतम तीन आधारभूत माप (स्वीप) करें।
नोट: यौगिक जोड़ने से पहले अनुबंध मॉड्यूल का उपयोग करके एक अनुबंध बेसलाइन माप का उदाहरण डेटा पूरक चित्र 4 में दर्शाया गया है - माप उपकरण से लचीली 96-वेल प्लेट को हटाए बिना प्रत्येक कुएं से परख बफर के 50 μL को हटा दें।
- माप योजना के अनुसार, प्लेट के प्रत्येक कुएं में 4x केंद्रित यौगिक समाधान का 50 μL जोड़ें।
- क्षेत्र मार्कर जोड़ें का चयन करें और यौगिक जोड़ने के बाद यौगिक प्लेट लेआउट और यौगिक समाधान की मात्रा को परिभाषित करें।
- अंत में, मानक माप के साथ आगे बढ़ें या प्रयोगात्मक योजना के अनुसार माप श्रृंखला के साथ आगे बढ़ें ।
6. डेटा विश्लेषण
- रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ, स्वीप मापें, जिनकी लंबाई और पुनरावृत्ति अंतराल उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किए जाते हैं।
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ, आयाम, बीट दर, पल्स चौड़ाई, आदि जैसे मापदंडों को स्वचालित रूप से पढ़कर सिग्नल के आकार को कैप्चर करें।
नोट: मानक विचलन, तथाकथित माध्य बीट सहित एक औसत संकेत स्वचालित रूप से एक स्वीप के डेटा के आधार पर गणना की जाती है। उपयोगकर्ता अनुबंध / आईएमपी / ईएफपी मापदंडों को परिभाषित कर सकता है जो सॉफ्टवेयर गणना और प्रदर्शित करता है। - विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक यौगिक के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र और आईसी 50 / ईसी 50 की गणना करें।
नोट: कच्चे डेटा और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उत्पन्न विश्लेषण परिणामों को आसानी से विभिन्न प्रारूपों में निर्यात किया जा सकता है। अंत में, प्रयोगात्मक परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करने और संग्रहीत करने के लिए डेटा रिपोर्ट स्वचालित रूप से उत्पन्न होती हैं। ईएफपी सिग्नल को क्या और कैसे मापा जाता है, इसका एक व्यापक विवरण 17 में चर्चा की गई है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एचआईपीएससी-सीएम की सिकुड़न पर काइनेज अवरोधक एर्लोटिनिब के प्रभाव चित्र 1 में दिखाए गए हैं। कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए 10 एनएम से 10 μM तक सांद्रता के साथ इलाज किया गया था और बीट पैरामीटर दैनिक दर्ज किए गए थे। एर्लोटिनिब, एक ईजीएफआर (एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर) और टायरोसिन किनेज इनहिबिटर जिसमें कार्डियोटॉक्सिसिटी का तुलनात्मक रूप से कम जोखिम होता है, का माइक्रोमोलर रेंज में सांद्रता पर ही एचआईपीएससी-सीएम पर मामूली खुराक और समय-निर्भर प्रभाव पड़ता है। सबसे कम सांद्रता (10 एनएम) पर, एर्लोटिनिब ने यौगिक अनुप्रयोग (1 घंटे) के बाद पहले माप पर आयाम में सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन कमी को प्रेरित किया। बाद के सभी मापों में, इस एकाग्रता पर कोई तुलनीय प्रभाव नहीं मापा गया था। क्षणिक कमी एक यौगिक प्रभाव का परिणाम हो सकती है, लेकिन यौगिक जोड़ प्रक्रिया के दौरान बीट पैटर्न के क्षणिक विकृति के परिणामस्वरूप भी हो सकती है, उदाहरण के लिए, थर्मल या यांत्रिक प्रकृति की। एर्लोटिनिब की माइक्रोमोलर सांद्रता ने मामूली लेकिन महत्वपूर्ण समय और खुराक-निर्भर कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव दिखाए। प्रभाव की शुरुआत 96 घंटे से 1 μM एर्लोटिनिब के साथ देखी गई थी, जबकि 10 μM के परिणामस्वरूप यौगिक जोड़ के केवल 24 घंटे बाद महत्वपूर्ण कमी आई थी।
कीमोथेरेपी एजेंट एपिरुबिसिन का एचआईपीएस-सीएम (चित्रा 2) पर समय और खुराक-निर्भर प्रभाव दोनों था। 10 μM epirubicin के आवेदन के बाद कोशिकाओं ने 24 घंटे के भीतर धड़कना बंद कर दिया। 1 μM के साथ, आयाम में 44% ± 24 घंटे के बाद नियंत्रण के 2% तक भारी कमी के बाद यौगिक जोड़ के 48 घंटे बाद तक पूर्ण बीट समाप्ति हुई। 100 एनएम पर, 5 दिनों की अवधि में बीट आयाम में समय-निर्भर कमी देखी गई, जिसमें 5 वें दिन 25% ± 3% के अवशिष्ट आयाम थे। 10 एनएम की सबसे कम सांद्रता पर, एपिरुबिसिन का प्रभाव केवल खुराक-निर्भर था, लेकिन समय-निर्भर नहीं था, जो पहले माप (यौगिक जोड़ के 1 घंटे बाद) से शुरू होता है। आयाम 5 दिनों की अवधि में नियंत्रण के 60% -80% के बीच लगातार उतार-चढ़ाव हुआ। इस समूह में विचलन उच्च सांद्रता की तुलना में बड़े थे। एक संभावित कारण यह तथ्य हो सकता है कि इस एकाग्रता का केवल कुओं के एक हिस्से पर औसत दर्जे का प्रभाव था।
डॉक्सोर्यूबिसिन दवा का एक और एंथ्रासाइक्लिन वर्ग है, और समय के साथ आधार प्रतिबाधा की निगरानी करके एचआईपीएससी-सीएम की सेल जीवन शक्ति की जांच की गई थी। चित्रा 3 से पता चलता है कि 300, 1, 3, और 10 μM डॉक्सोर्यूबिसिन के लिए 24 घंटे के संपर्क में आने से कोशिका व्यवहार्यता एकाग्रता- और समय-निर्भर तरीके से कम हो जाती है।
निफेडपिनी एक डाइहाइड्रोपाइरिडाइन कैल्शियम चैनल ब्लॉकर है जो मुख्य रूप से एल-प्रकार के कैल्शियम चैनलों को अवरुद्ध करता है। सेल व्यवहार्यता के 24 घंटे से अधिक दीर्घकालिक निगरानी से आधार प्रतिबाधा की समय और एकाग्रता-निर्भर कमी का पता चलता है जिसका उपयोग विषाक्तता के उपाय के रूप में किया जाता है (चित्रा 4 ए)। निफेडिपिन सांद्रता (3 एनएम, 10 एनएम, 30 एनएम, 100 एनएम) में वृद्धि के आवेदन पर, एचआईपीएससी-सीएम पर फील्ड संभावित रिकॉर्डिंग से अपेक्षित क्षेत्र अवधि सामान्यीकृत (एफपीडी) की एकाग्रता-निर्भर कमी का पता चलता है (चित्रा 4 बी, सी)। कार्डियक सिकुड़न के बारे में निफेडिपिन मूल्यांकन ने 10 एनएम और 30 एनएम सांद्रता (चित्रा 5) के साथ तीव्र माप पर एक महत्वपूर्ण एकाग्रता-निर्भर आयाम में कमी भी दिखाई।
हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली के साथ प्राप्त परिणाम दर्शाते हैं कि एचआईपीएससी-सीएम के तीन कार्डियक एंडपॉइंट (अनुबंध, संरचना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) का मूल्यांकन एक प्रणाली का उपयोग करके किया जा सकता है।
चित्रा 1: 5 दिनों के लिए एर्लोटिनिब के साथ इलाज किए गए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का अनुबंध मूल्यांकन। एक्स-अक्ष घंटों में समय दिखाता है, वाई-अक्ष प्रतिशत के संदर्भ में पैरामीटर आयाम को प्लॉट करता है। तारांकन चिह्न पी < 0.05 (*) या पी < 0.01 (**) (विलकॉक्सन मान व्हिटनी परीक्षण, एन = 4) के साथ सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: 5 दिनों में कार्डियोटॉक्सिक एंथ्रासाइक्लिन एपिरुबिसिन के साथ इलाज किए गए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का अनुबंध मूल्यांकन। एक्स-अक्ष घंटों में समय दिखाता है, वाई-अक्ष प्रतिशत के संदर्भ में पैरामीटर आयाम को प्लॉट करता है। तारांकन चिह्न p < 0.05 (*) या p < 0 के साथ सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। 01 (**) (विलकॉक्सन मान व्हिटनी परीक्षण, एन = 4)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: डॉक्सोर्यूबिसिन उपचार के बाद मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का आधार प्रतिबाधा। 300, 1, 3, और 10 μM डॉक्सोर्यूबिसिन (एन = 5) के लिए 24 घंटे के संपर्क के लिए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के आधार प्रतिबाधा का समय पाठ्यक्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिबाधा और ईएफपी रिकॉर्डिंग। (ए) 3, 10, 30, और 100 एनएम निफेडिपिन (एन = 5) के संपर्क में आने पर 24 घंटे के लिए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के आधार प्रतिबाधा का समय पाठ्यक्रम। (बी) 3, 10, 30, और 100 एनएम निफेडिपिन (एन = 5) के संपर्क में आने पर 1 घंटे के लिए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की क्षेत्र संभावित अवधि का समय पाठ्यक्रम। (सी) प्रतिबाधा / ईएफपी प्लेट का इलेक्ट्रोड लेआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का अनुबंध मूल्यांकन (अनुबंध मॉड्यूल) 20 मिनट के लिए निफेडिपिन के साथ इलाज किया जाता है। एक्स-अक्ष प्रतिशत के संदर्भ में न्यूनतम, वाई-अक्ष प्लॉट पैरामीटर आयाम में समय दिखाता है। तारांकन चिह्न पी < 0 के साथ सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। 05 (*) या पी < 0.01 (**) (विलकॉक्सन मैन व्हिटनी टेस्ट, एन = 4)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 1: अनुबंध ता्मकता पैरामीटर और कच्चे डेटा का मूल्यांकन अनुबंध मॉड्यूल के साथ किया जाता है। (बाएं) अनुबंध मॉड्यूल के साथ मूल्यांकन किए गए पैरामीटर। पैरामीटर: संकुचन बल का आयाम (एमएन / मिमी2), बीट अवधि, अपस्ट्रोक, और डाउनस्ट्रोक वेग, अपस्ट्रोक, और डाउनस्ट्रोक क्षेत्र अंडर कर्व (एयूसी), बीट दर, बीट दर भिन्नताएं, लयबद्ध घटनाएं। (दाएं) अनुपचारित कार्डियोमायोसाइट (ए) बीट दर, (बी) बीट दर भिन्नता, (सी) संकुचन के बाद जल्दी, और (डी) लयबद्ध घटनाओं के साथ एक कुएं की अनुबंधित कच्ची डेटा रिकॉर्डिंग। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 2: अनुबंध और प्रतिबाधा / ईएफपी माप के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 3: 96-वेल प्लेट के लिए माप योजना का उदाहरण लेआउट। चार सांद्रता और चार प्रतिकृतियों के साथ चार यौगिक (लाल, हल्के हरे, भूरे और गहरे हरे रंग में हाइलाइट किए गए हैं)। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (जैसे, पूर्व-संस्कृति स्थितियां और डीएमएसओ) पीले रंग में हाइलाइट किए गए हैं। बैकअप कक्ष नीले रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 4: यौगिक जोड़ने से पहले अनुबंध मॉड्यूल का उपयोग करके एक अनुबंध बेसलाइन माप का उदाहरण डेटा। प्रत्येक चार्ट में एक स्वीप के सभी संकुचन चक्रों का औसत दर्शाया गया है। बीट दर की कल्पना करने के लिए, दो लगातार संकुचन दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रतिबाधा/ईएफपी/कॉन्ट्रैक्टिलिटी हाइब्रिड प्रणाली प्रीक्लिनिकल दवा विकास के लिए हृदय संबंधी देनदारियों के उच्च थ्रूपुट सुरक्षा औषधीय और विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए एक व्यापक पद्धति है। यह पशु मॉडल के उपयोग के बिना प्रीक्लिनिकल सुरक्षा परीक्षण के लिए एक आधुनिक दृष्टिकोण प्रदान करता है, लेकिन उच्च थ्रूपुट क्षमताओं के साथ जो समय और लागत को काफी कम करता है। इस प्रणाली में प्रीक्लिनिकल कार्यात्मक और संरचनात्मक विषाक्तता मूल्यांकन के लिए लैंगेंडॉर्फ हार्ट और अन्य पशु मॉडल के लिए पूरक दृष्टिकोण के रूप में उपयोग करने की क्षमता है।
पशु-मुक्त दृष्टिकोण के रूप में, मानव आईपीएससी-सीएम हाइब्रिड सिस्टम20 के लिए नियोजित हैं। यहां, मानव आईपीएससी-सीएम पर प्रो-परिपक्वता प्रभाव के साथ विशेष लचीली 96-वेल प्लेटें अन्य सेल-आधारित परख21,22 की तुलना में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती हैं, क्योंकि थ्रूपुट और एक शारीरिक वातावरण विशिष्ट रूप से अधिक वयस्क जैसे मानव हृदय जोखिम मूल्यांकन 6,15 के लिए संयुक्त हैं।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यौगिक का अनुप्रयोग है, खासकर जब तीव्र प्रभावों की जांच की जानी है। चूंकि कोशिकाओं को नरम सब्सट्रेट्स पर संवर्धित किया जाता है जो यांत्रिक बलों का संचालन करते हैं, प्लेट हैंडलिंग के दौरान अत्यधिक त्वरण और पाइपिंग के दौरान कतरनी बलों के आवेदन के परिणामस्वरूप संकुचन मापदंडों के क्षणिक (5-10 मिनट) परिवर्तन हो सकते हैं और इससे बचा जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, झिल्ली के विघटन से बचने के लिए मीडिया प्रतिस्थापन के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। प्रयोगशाला स्वचालन उपकरण के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
यौगिक विश्लेषण किए जाने से पहले, 5-7 दिनों के पूर्व-संस्कृति चरण की आवश्यकता होती है, ताकि मानव आईपीएससी-सीएम, आमतौर पर क्रायो-संरक्षित अवस्था में प्राप्त होते हैं, पिघलने की प्रक्रिया से उबर सकते हैं और एक उचित सिंकेटियम का निर्माण कर सकते हैं। दोनों मॉड्यूल के लिए, संकुचन आयाम, साथ ही बीटिंग दर, माप के आदर्श प्रारंभिक बिंदु में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है जो आमतौर पर 5-7 दिनों के बीच होती है। बेसलाइन माप अध्ययन किए गए एचआईपीएससी-सीएम के लिए समावेश मानदंड के रूप में उपयोग की जाने वाली कार्यात्मक आधारभूत विशेषताओं की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदमहै। यौगिक उपचार से ठीक पहले बेसलाइन मूल्यों को दर्ज करने की आवश्यकता होती है ताकि संकुचन व्यवहार में परिवर्तन की तुलना गैर-उपचार स्थितियों (पूरक चित्रा 3) से की जा सके।
वैरिएबिलिटी के लिए लेखांकन और परिभाषित आधारभूत विशेषताओं के लिए एचआईपीएससी-सीएम और डेटा व्याख्या के सफल माप की कुंजी है। इस कारण से, गिनेंट एट अल से सर्वोत्तम अभ्यास सिफारिशों का पालन हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है; उदाहरण के लिए, बेसलाइन को यौगिक जोड़ने से पहले दर्ज किया जाना है, और बेसलाइन रिकॉर्डिंग को कुछ शर्तों को पूरा करना चाहिए।
यद्यपि लचीली 96-वेल प्लेटें नाजुक झिल्ली से लैस हैं, सावधानीपूर्वक हैंडलिंग के साथ संयोजन में एक प्रदान की गई रक्षक प्लेट क्षति को रोक देगी। सिलिकॉन सब्सट्रेट के लिए कोशिकाओं के स्थिर लगाव को सक्षम करने के लिए झिल्ली का पूर्व-उपचार किया जाता है, जिसमें कम आंतरिक जैव-रासायनिकता होती है। उपचार कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर है। जबकि कोशिकाओं को लगातार 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है, सिलिकॉन सामग्री के यांत्रिक गुण तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर स्थिर होते हैं। इसके अतिरिक्त, न तो दवाएं और न ही सॉल्वैंट्स सेल-आधारित परख में उपयोग की जाने वाली सांद्रता में सिलिकॉन के गुणों को प्रभावित करते हैं (उदाहरण के लिए, डीएमएसओ सांद्रता 0.1% से नीचे रहती है)।
प्रणाली को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध HIPSC-CM की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ मान्य और अनुकूलित किया गया था। कस्टम-निर्मित कोशिकाओं का उपयोग करते समय, इष्टतम सेल अटैचमेंट के लिए मानक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है (जैसे, फाइब्रोनेक्टिन, ईएचएस मैट्रिक्स, और पॉली-एल-लाइसिन 6,15)।
इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम सिग्नलिंग और सिकुड़न तीन मुख्य कार्डियक एंडपॉइंट हैं जिन्हें प्रीक्लिनिकल विकास में संबोधित किया जा रहा है। हाइब्रिड सिस्टम वर्तमान में इनमें से दो कार्डियक एंडपॉइंट्स-कॉन्ट्रैक्टिलिटी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का विश्लेषण करने तक सीमित है। कार्डियोमायोसाइट्स में कैल्शियम सिग्नलिंग का सीधे विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, लेकिन अनुबंध और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के माध्यम से स्पर्शरेखीय रूप से पता लगाया जाता है।
ईएफपी के साथ-साथ संकुचन बल माप दोनों कार्डियोमायोसाइट्स के मोनोलेयर के साथ किए जाते हैं। संकुचन माप के दौरान एक शारीरिक यांत्रिक सब्सट्रेट कठोरता के लाभ के बावजूद, कोशिकाएं वास्तविक मानव ऊतक के त्रि-आयामी वातावरण का अनुभव नहीं करती हैं। दूसरी ओर, यह मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ महंगे स्टेम सेल-व्युत्पन्न सेल मॉडल के केवल एक अंश के उपयोग की अनुमति देता है। इसलिए, यह एप्लिकेशन विवो / एक्स विवो या 3 डी मॉडल की तुलना में लागत, मजबूती और भविष्यवाणी का अनुकूल संबंध रखने का वादा करता है। हाइब्रिड सिस्टम के भविष्य के अनुप्रयोगों में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं जैसे अन्य सिकुड़ा हुआ सेल प्रकारों का विश्लेषण शामिल हो सकता है। कार्डियोवैस्कुलर होमियोस्टैसिस के नियमन में, ये कोशिकाएं कार्डियोमायोसाइट्स के समकक्षों के रूप में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं। हाइब्रिड सिस्टम विशिष्ट परियोजनाओं के लिए ऐड-ऑन भी प्रदान करता है, जैसे कि मानव आईपीएससी-सीएम की ऑप्टिकल उत्तेजना। इस उद्देश्य के लिए, मानव आईपीएससी-सीएम की उत्तेजना के लिए दोनों मॉड्यूल पर एक समर्पित ऑप्टिकल ढक्कन लागू किया जा सकता है जो प्रीकल्चर समय के दौरान चैनलरोडोप्सिन -2 के साथ स्थानांतरित किए गए थे।
इस प्रकार, प्रतिबाधा / ईएफपी / कॉन्ट्रैक्टिलिटी हाइब्रिड सिस्टम एक पद्धति के भीतर तीन अलग-अलग कार्डियक एंडपॉइंट (कॉन्ट्रैक्टिलिटी, संरचनात्मक परिवर्तन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) का विश्लेषण करके आधुनिक प्रीक्लिनिकल सुरक्षा और विषाक्तता मूल्यांकन की अनुमति देता है। उच्च थ्रूपुट स्तर पर मानव-आधारित कार्डियक सेल मॉडल के साथ इन समापन बिंदुओं को संबोधित करने का लाभ इस हाइब्रिड प्रणाली को प्रीक्लिनिकल कार्डियक जोखिम मूल्यांकन के वर्तमान दृष्टिकोण से परे उठाता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
बी.एल., एम.गो., और पी.एल. लचीली प्लेटों के निर्माता इनोविट्रो जीएमबीएच में कार्यरत हैं। यू.टी., ई.डी., एम.एल., M.Ge., एन.एफ., और एस.एस. हाइब्रिड डिवाइस के निर्माता Nanion Technologies GmbH में कार्यरत हैं।
Acknowledgments
इस काम को जर्मन संघीय आर्थिक मामलों और जलवायु कार्रवाई मंत्रालय (ZIM) और जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (KMUinnovativ) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्रदान करने के लिए फुजीफिल्म सेलुलर डायनेमिक्स, इंक (मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए) और एनकार्डिया बीवी (लीडेन, नीदरलैंड) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
