Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Summary

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Abstract

Kanker is een grote uitdaging geweest in de wereldwijde gezondheid. De complexe micro-omgeving van de tumor beperkt echter over het algemeen de toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen, wat leidt tot tumorrecidief. Om de beperkte penetratie van biologische barrières te overwinnen, zijn celdoordringende peptiden (CPP’s) ontdekt met een uitstekend membraantranslocatievermogen en zijn ze naar voren gekomen als nuttige moleculaire transporters voor het afleveren van verschillende ladingen in cellen. Conventionele lineaire CPP’s vertonen echter over het algemeen een gecompromitteerde proteolytische stabiliteit, wat hun permeabiliteit over biologische barrières beperkt. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die biologische barrières kunnen binnendringen en een verbeterde proteolytische stabiliteit vertonen, is dus zeer gewenst om de efficiëntie van de toediening van geneesmiddelen in biomedische toepassingen te bevorderen. We hebben eerder een panel van korte cyclische CPP’s gesynthetiseerd met aromatische crosslinks, die een superieure permeabiliteit in kankercellen en weefsels vertoonden in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Hier wordt een beknopt protocol beschreven voor de synthese van het fluorescerend gelabelde cyclische polyarginine R8-peptide en zijn lineaire tegenhanger, evenals belangrijke stappen voor het onderzoeken van hun celpermeabiliteit.

Introduction

De afgelopen decennia zijn getuige geweest van snelle vooruitgang in de ontwikkeling van celdoordringende peptiden (CPP’s) voor medicijnafgifte. CPP’s zijn op grote schaal gebruikt als moleculaire transporters voor de behandeling van een reeks levensbedreigende ziekten, waaronder neurologische aandoeningen^1,2, hartaandoeningen³, diabetes⁴, dermatose⁵ en kanker ^6,7. Kanker blijft een wereldwijde gezondheidslast die gepaard gaat met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit, ondanks wijdverspreide onderzoeksinspanningen⁸. Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières zoals compacte extracellulaire matrix (ECM), abnormale tumorvasculatuur, meerdere membraanbarrières en hoge interstitiële vloeistofdruk (IFP)⁹. Daarom wordt het ontwikkelen van nieuwe CPP’s met een superieur vermogen om ladingen over biologische barrières te leveren beschouwd als een essentiële strategie voor de behandeling van kanker^10,11.

CPP’s kunnen worden onderverdeeld in kationische, amfipathische en hydrofobe CPP’s in termen van hun fysisch-chemische eigenschappen¹². Onder deze, de positief geladen HIV-TAT peptide en de synthetische polyarginine zijn van aanzienlijk belang in biomedisch onderzoek en zijn uitgebreid bestudeerd om intracellulaire drug delivery^{te vergemakkelijken 13}. Tunnemann et al. rapporteerden dat een minimale lengte van acht arginines essentieel is voor efficiënte celpenetratie van de synthetische polyargininepeptiden, gebaseerd op een celpermeabiliteitsstudie uitgevoerd met R3 tot R12-peptiden¹⁴. Deze CPP’s hebben echter over het algemeen een korte plasmahalfwaardetijd vanwege hun snelle hydrolyse in vivo. Bovendien is er weinig bekend over de optimalisatie van de chemische structuur van CPP’s om hun transbarrièrevermogen te vergroten, omdat het een uitdaging is om meerdere celmembranen te penetreren¹⁵. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te penetreren sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. In 2020 ontdekten Komin et ^al.16 een CPP genaamd CL-peptide, dat een helixmotief (RLLRLLR) en een polyargininestaart (R7) bevat voor het kruisen van de epitheliale monolaag. Een reeks CL-peptidevarianten werd ook gesynthetiseerd door het spiraalvormige patroon te veranderen. Deze verkenning zou een belangrijke leidraad kunnen zijn voor de ontwikkeling van nieuwe CPP’s voor de levering van ladingen over biologische barrières. Bovendien optimaliseerden Dietrich et al. de celdoorlaatbaarheid van het StAX-peptide, waardoor de Wnt/β-catenine-signaleringsroute werd geremd door de algehele hydrofobiciteit van de peptiden te verhogen¹⁷.

Conformatiebeperking van ongestructureerde lineaire peptiden door cyclisatie is een effectieve manier om hun proteolytische stabiliteit en permeabliteit te verbeteren^18,19,20. De structurele versterking verhoogt de proteaseweerstand van cyclische peptiden, waardoor ze in vivo stabieler zijn in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Bovendien kan de cyclisatie van peptiden mogelijk de polaire peptide-ruggengraat maskeren door intramoleculaire waterstofbinding te bevorderen, waardoor de membraandoorlaatbaarheid van de peptiden wordt verhoogd²¹. In de afgelopen twee decennia zijn chemoselectieve cyclisatiemethoden effectieve strategieën geworden voor de constructie van cyclische peptiden met verschillende architecturen, zoals all-hydrocarbon, lactam, triazole, m-xyleen, perfluoroaryl en andere cross-links^22,23. De biologische barrière opgelegd door de geavanceerde tumormicro-omgeving zou de penetratie van geneesmiddelen in solide tumoren kunnen verminderen²⁴. We hebben eerder ontdekt dat de cyclische CPP’s een superieure weerstand tegen enzymatische spijsvertering vertoonden ten opzichte van hun lineaire tegenhangers²⁰. Bovendien is de algehele hydrofobiciteit van de peptiden van cruciaal belang voor hun verbeterde celdoorlaatbaarheid²². Op basis van de hierboven besproken studies kan de combinatie van een positief geladen patroon, verhoogde algehele hydrofobiciteit en verbeterde proteolysestabiliteit worden verondersteld om de permeabiliteit van CPP’s over biologische barrières heen te vergroten. In een recente studie identificeerden we twee cyclische CPP’s met aromatische crosslinks op posities i en i + 7 die een verbeterde permeabiliteit in tumorcellen en weefsels vertonen in vergelijking met hun lineaire tegenhangers¹⁵. Hier wordt een beknopt synthetisch protocol gepresenteerd voor de synthese van fluorescerend gelabelde cyclische CPP’s en de belangrijkste stappen om hun permeabiliteit te onderzoeken.

Protocol

1. Voorbereiding van de apparatuur OPMERKING: Voer alle procedures uit in een werkende zuurkast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Monteer het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast (figuur 1). Plaats de driewegkranen (zie materiaaltabel) op het vacuümspruitstuk (zie materiaaltabel) en sluit aan op de stikstof (N2). Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit.</l…

Representative Results

In dit protocol werd een synthetische procedure gepresenteerd om de lineaire polyarginine R8 in zijn cyclische vorm te beperken. De SPPS werd handmatig uitgevoerd met behulp van een eenvoudig apparaat (figuur 1). Het gedetailleerde synthetische proces van SPPS is weergegeven in figuur 2. Kortom, de hars was voldoende opgezwollen, gevolgd door deprotection van de N α-Fmoc beschermingsgroep. Vervolgens werd het N-α-Fmoc-beschermde ami…

Discussion

De chemische stabilisatie van peptiden door conformationele beperkingen op te nemen, is een effectieve strategie gebleken voor het verbeteren van de stabiliteit en celdoorlaatbaarheid van het peptide²⁶. In dit protocol wordt een stapsgewijze procedure beschreven voor de synthese van cyclische CPP’s met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen. Vergeleken met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen^22,27, ve…

Materials

1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231