Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains
Summary
Ce protocole décrit le processus de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) en cellules de type microglie pour l’expérimentation in vitro . Nous incluons également une procédure détaillée pour générer des synaptosomes humains à partir de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC qui peuvent être utilisés comme substrat pour des tests de phagocytose in vitro utilisant des systèmes d’imagerie de cellules vivantes.
Abstract
Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes d’origine myéloïde qui maintiennent l’homéostasie dans le microenvironnement cérébral et sont devenues un acteur clé dans de multiples maladies neurologiques. L’étude de la microglie humaine dans la santé et la maladie représente un défi en raison de l’approvisionnement extrêmement limité en cellules humaines. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dérivées d’individus humains peuvent être utilisées pour contourner cette barrière. Ici, il est démontré comment différencier les CSPi humaines en cellules de type microglie (iMG) pour l’expérimentation in vitro . Ces iMG présentent les propriétés attendues et physiologiques de la microglie, y compris la morphologie de type microglie, l’expression de marqueurs appropriés et la phagocytose active. De plus, une documentation pour isoler et étiqueter les substrats de synaptosomes dérivés de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC humaine (i3LMN) est fournie. Un test d’imagerie longitudinale sur cellules vivantes est utilisé pour surveiller l’engloutissement des synaptosomes humains marqués avec un colorant sensible au pH, ce qui permet d’étudier la capacité phagocytaire de l’iMG. Les protocoles décrits ici sont largement applicables à différents domaines qui étudient la biologie de la microglie humaine et la contribution de la microglie à la maladie.
Introduction
Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) et jouent un rôle crucial dans le développement du SNC. Les microglies sont également importantes dans le cerveau adulte pour maintenir l’homéostasie et répondre activement aux traumatismes et aux processus pathologiques. Les preuves cumulatives montrent que les microglies sont des contributeurs clés à la pathogenèse de multiples maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives 1,2. Bien que les connaissances actuelles sur la biologie microgliale proviennent principalement de modèles murins, des études récentes ont élucidé des différences importantes entre la microglie murine et la microglie humaine, soulignant la nécessité de développer des technologies pour étudier la génétique et les fonctions biologiques de la microglie humaine 3,4. L’isolement de la microglie à partir de tissu primaire disséqué peut modifier gravement les propriétés de la microglie5, ce qui peut confondre les résultats obtenus avec de telles cellules. L’objectif global de cette méthode est de différencier les CSPi humaines en MAGi, fournissant ainsi un système de culture cellulaire pour étudier la microglie humaine dans des conditions basales. De plus, un test de phagocytose utilisant un système modèle entièrement humain est inclus ici comme moyen d’étudier la fonctionnalité des MGi, à la fois comme mesure de contrôle de la qualité et pour évaluer le dysfonctionnement de l’iMG dans le contexte de la maladie.
De multiples protocoles de différenciation de la microglie par rapport aux CSPi ont récemment émergé dans la littérature 6,7,8,9,10. Les inconvénients potentiels de certains protocoles comprennent des périodes de différenciation prolongées ou longues, l’ajout de facteurs de croissance multiples et/ou des procédures expérimentales complexes 6,9,10. Ici, une méthode de différenciation « conviviale » est démontrée qui récapitule les aspects de l’ontogenèse de la microglie par la différenciation des CSPi en cellules précurseurs appelées précurseurs primitifs de macrophages (PMP)7,11. Les PMP sont générés comme décrit précédemment, avec quelques optimisations présentées ici12. Les PMP imitent les macrophages dérivés du sac vitellin indépendants du MYB, qui donnent lieu à une microglie au cours du développement embryonnaire en envahissant le cerveau avant la fermeture de la barrière hémato-encéphalique13. Pour différencier de manière terminale les PMP en iMG, nous avons utilisé une méthode de monoculture rapide et simplifiée basée sur les protocoles de Haenseler et al. et Brownjohn et al., avec quelques modifications pour générer une méthode efficace de différenciation de la microglie dans laquelle les iMG expriment de manière robuste les marqueurs enrichis en microglies 7,8. Cette méthode de différenciation peut être reproduite dans des laboratoires ayant une expertise dans la culture des CSPi et ayant des objectifs de recherche visant à étudier la biologie de la microglie à l’aide d’un système modèle humain.
Les microglies dérivées des CSPi représentent une source biologiquement pertinente de microglies humaines pour l’expérimentation in vitro et constituent un outil important pour étudier les fonctions canoniques microgliales, y compris la phagocytose. Les microglies sont les phagocytes professionnels du cerveau et du SNC, où ils éliminent les débris cellulaires, les protéines agrégées et la myéline dégradée14. La microglie fonctionne également dans le remodelage synaptique en engloutissant les synapses et dans la défense contre les infections externes par phagocytose des agents pathogènes15,16. Dans ce protocole, la phagocytose par les iMG est évaluée à l’aide de synaptosomes humains comme matériau pour l’engloutissement de l’iMG. À cette fin, une description de l’isolement des synaptosomes dérivés de LMN i3humains est décrite. Les synaptosomes humains dérivés du LMN3sont marqués avec un colorant sensible au pH qui permet de quantifier les synaptosomes localisés dans les compartiments acides pendant le traitement et la dégradation des phagosomes in vitro. Un test de phagocytose utilisant la microscopie sur cellules vivantes est montré pour surveiller le processus dynamique d’engloutissement de la microglie en temps réel. Ce test fonctionnel établit une base pour étudier les défauts possibles de la phagocytose microgliale dans la santé et la maladie en utilisant un système humain complet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de différenciation décrit ici fournit une méthode efficace pour obtenir des cellules de type microglie dérivées de l’iPSC en ~6-8 semaines avec une pureté élevée et un rendement suffisant pour effectuer des expériences d’immunofluorescence et d’autres tests nécessitant un plus grand nombre de cellules. Ce protocole a donné jusqu’à 1 × 106 iMGs en 1 semaine, ce qui permet l’extraction de protéines et d’ARN et les analyses correspondantes en aval (par exemple, RNASeq, qRT-P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Michael Ward d’avoir fourni la ligne iPSC hNIL du WTC11 pour la différenciation des motoneurones et les Laboratoires Jackson d’avoir fourni la ligne iPSC clone B03 du clone KOLF2.1J WT utilisée pour la différenciation de la microglie. Nous remercions également Dorothy Schafer pour son soutien lors de la mise en œuvre des protocoles, Anthony Giampetruzzi et John Landers pour leur aide avec le système d’imagerie de cellules vivantes ainsi que Hayden Gadd pour ses contributions techniques lors des révisions et Jonathan Jung pour sa collaboration à cette étude. Ce travail a été soutenu par le Fonds Dan et Diane Riccio pour les neurosciences de l’UMASS Chan Medical School et le Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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