Summary

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto

Published: September 26, 2022
doi:

Summary

L’ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale murino di dermatite allergica da contatto (ACD). ChS si basa sulla sensibilizzazione con hapten reattivo dipingendo la pelle rasata del torace e dell’addome, con una successiva sfida della pelle dell’orecchio con un hapten diluito, causando una reazione di gonfiore che viene valutata in vari modi.

Abstract

L’ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale di dermatite allergica da contatto (ACD) che può essere studiato nei topi. Questo studio mira a presentare un metodo di laboratorio oggettivo che può aiutare a studiare la reazione CHS nei topi, che può essere misurata e quantificata da vari test. Per indurre CHS, il giorno “0”, i topi sono stati sensibilizzati su un punto precedentemente rasato dipingendo la pelle addominale con l’apteten 2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB) in una miscela acetone-etanolo, mentre i topi a controllo negativo sono stati sensibilizzati fintamente con la miscela veicolo da solo-acetone-etanolo. Il giorno “4”, lo spessore dell’orecchio di base è stato misurato con un micrometro prima dell’elicitazione di CHS (sfida) dipingendo entrambe le orecchie con TNCB diluito sia nel gruppo di prova che in quello di controllo. Dopo 24 ore, il gonfiore dell’orecchio è stato misurato con un micrometro. CHS è un esempio di una risposta immunitaria mediata da cellule T che provoca gonfiore nel tessuto infiammato, con un picco di 24 ore dopo la sfida cutanea con lo stesso apteno. Un aumento dell’edema dell’orecchio correlato all’aumento del peso dell’orecchio, all’attività della mieloperossidasi (MPO), alla concentrazione di citochine pro-infiammatorie negli estratti dell’orecchio, all’aumento dell’ispessimento del derma edematoso nell’esame istologico e alla permeabilità vascolare dell’orecchio. C’è stato anche un aumento della concentrazione di anticorpi IgG1 specifici del TNP nei sieri del gruppo di test rispetto ai topi di controllo. Inoltre, chs può essere trasferito con successo con le cellule effettrici CHS ottenute da donatori precedentemente sensibilizzati con TNCB. Le cellule effettrici CHS sono state somministrate per via endovenosa in topi riceventi naïve, che sono stati successivamente sfidati con lo stesso apteno diluito. Il gonfiore dell’orecchio è stato misurato con un micrometro 24 ore dopo.

Introduction

La dermatite allergica da contatto (ACD) è una comune malattia infiammatoria della pelle nei paesi industrializzati causata da una reazione di ipersensibilità di tipo IV derivante dall’esposizione a sostanze chimiche a basso peso molecolare chiamate apteni. Le sostanze che causano sensibilizzazione al contatto nell’uomo includono ioni di metalli pesanti (cromo, nichel, ferro, cobalto), trementina, profumi, coloranti e conservanti presenti nei cosmetici (ad esempio, p-fenilendiammina), alcuni farmaci (ad esempio, neomicina, benzocaina), antibiotici β-lattamici (cioè penicillina), sostanze chimiche prodotte dalle piante (pentadecacatecolo, una sostanza presente nell’edera velenosa), nonché idrochinone-utilizzato nell’industria fotografica 1,2 . Gli agenti eziologici ACD sono molto alti in quanto oltre 100.000 sostanze chimiche sono utilizzate solo nell’industria e 2.000 nuove vengono sintetizzate ogni anno. Ad oggi, sono state identificate più di 3.700 molecole che possono essere apteni/allergeni da contatto3. La reazione di ipersensibilità al contatto (CHS) è un modello sperimentale di ACD che può essere studiato in topi, porcellini d’India e ratti e può essere indotto dall’applicazione topica cutanea di apteni chimici reattivi disciolti in solventi organici 4,5,6. Questo studio mira a descrivere un metodo di laboratorio oggettivo che può aiutare a studiare la reazione CHS nei topi, che può essere misurata e quantificata da vari test.

Il CHS è costituito da fasi di sensibilizzazione (induzione) ed effettore (sfida). Nei modelli animali, gli apteni si legano prima covalentemente alle proteine del corpo per creare neoantigeni. Durante la fase di sensibilizzazione, i cheratinociti attivati favoriscono la migrazione e la maturazione delle cellule dendritiche cutanee (sDC) producendo citochine pro-infiammatorie-fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) e interleuchina 1β (IL-1β)7. Le cellule epidermiche di Langerhans (LCs) presentano antigeni durante l’induzione chs e le fasi effettrici8. Le LC esposte all’aptene durante la sensibilizzazione promuovono l’induzione delle cellule regolatorie ed effettrici9. Prove crescenti da diversi studi suggeriscono che le risposte CHS possono essere mediate da cellule Th1 cd4 + MHC di classe II limitate, rilasciando localmente interferone-γ (IFN-γ) per impiegare un caratteristico infiltrato infiammatorio, linfociti Tc1 CD8 + MHC di classe I che possono anche rilasciare IFN-γ ma soprattutto mediare danni citotossici ai cheratinociti, e ora anche le cellule Th17 che producono interleuchina 17 (IL-17)10, 11.

Sono stati sviluppati diversi modelli CHS che impiegano varie specie1 2,13,14 e apteni (un confronto dettagliato di diversi apteni, solventi e tempo di applicazione è riassunto nella Tabella 1). Il topo, una specie di laboratorio frequentemente utilizzata, offre alcuni vantaggi nello studio della CHS. Ci sono più ceppi, knockout (KO) e animali transgenici tra i topi rispetto ad altre specie, il che li rende un animale molto attraente15. Inoltre, il modello CHS richiede molti animali e i topi sono più economici qui. I modelli animali non imitano l’ACD in tutti gli aspetti; in particolare, mostrano croste e desquamazione, che non è comune perl’uomo 16,17. Le caratteristiche della malattia cronica sono difficili da riprodurre, principalmente perché il modello descritto non presuppone l’applicazione dell’apteno per un lungo periodo di tempo. Tuttavia, è stato confermato qui che molti degli aspetti significativi dell’ACD sono riprodotti. È stato anche dimostrato che, come negli esseri umani, queste caratteristiche sono associate a reazioni allergiche locali. La scelta dell’apteno, il suo solvente e la sua applicazione delineati in questo protocollo sono stati dettati dal fatto che i risultati sono stati confermati da numerosi test in vitro e che è stato testato e modificato in laboratorio per molti anni fino a quando non è stata stabilita la versione attuale. I modelli murini consentono l’analisi dei sottoinsiemi cellulari o delle citochine che sono coinvolti nello sviluppo dell’ACD e sono essenziali per le valutazioni precliniche di nuovi trattamenti.

Protocol

Tutti gli esperimenti presentati in questo articolo sono stati condotti secondo le linee guida del 1 ° Comitato etico locale sulla sperimentazione animale a Cracovia. Tutte le procedure descritte sono state eseguite secondo le raccomandazioni locali, in particolare per quanto riguarda l’uso di ketamina / xilazina come anestetico, utilizzando entrambi i lati delle orecchie per applicare la sostanza / aptena, tagliando l’orecchio e raccogliendo sangue mediante rimozione del bulbo oculare. Per il presente studio sono stati…

Representative Results

Per l’induzione CHS, gli animali sono stati sensibilizzati tramite verniciatura della pelle (addominale) con 150 μL del 5% di TNCB o finta sensibilizzati con il solo veicolo. Il giorno “4”, le risposte di gonfiore dell’orecchio di entrambe le orecchie sono state indotte dalla pittura a contatto (sfida) con 10 μL di TNCB allo 0,4% in entrambi i topi precedentemente sensibilizzati al contatto con TNCB (gruppo di test) e topi del gruppo di controllo (sham sensibilizzato). I dati presentati mostrano che i topi sen…

Discussion

La CHS è indotta tramite apteni, che si legano agli antigeni autoproteici nella pelle, creando neoantigeni. La CHS è mediata dal reclutamento extravascolare locale di cellule T effettrici CHS antigene-effettrici circolanti, che provoca gonfiore nel tessuto sfidato, con un picco di 24 ore dopo l’esposizione della pelle secondaria allo stesso aptenato6. Il gonfiore del tessuto è causato principalmente dall’infiltrazione di leucociti e dalla deposizione di fibrina leucocitaria-dipendente<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione SUBZ. A020.22.060 dell’Università di Medicina di Wroclaw, Polonia, e da sovvenzioni del Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.

Materials

70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

References

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Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

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