Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.
De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.
Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de activering van RIPK3 na RIP homotypische interactie motief (RHIM)-gemedieerde interacties met een van de drie upstream activerende moleculen: RIPK1 (bij TNF receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF; op Toll-like receptor 3 en 4 engagement), of de antivirale nucleïnezuursensor Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . Necroptose signalering verloopt door een reeks fosforylering gebeurtenissen beginnend met de autofosforylering van RIPK3. De autofosforylering van humaan RIPK3 bij serine (S)227 binnen zijn kinasedomein is een voorwaarde voor necroptose door de interactie met MLKL mogelijk te maken en wordt vaak gebruikt als biochemische marker voor humane RIPK3-activering en necroptotische celdood 1,5. Eenmaal geactiveerd, fosforyleert RIPK3 de activeringslus van MLKL bij threonine (T) 357 en S3581. Dit veroorzaakt een verandering in MLKL-conformatie, wat resulteert in blootstelling van het N-terminal vier helixbundeldomein. MLKL oligomeriseert vervolgens en verkeert naar het celmembraan waar het een porie vormt door het inbrengen van de blootgestelde vier helixbundels in de lipide bilayer, wat uiteindelijk leidt tot celdood 2,6.
ZBP1 is een antivirale nucleïnezuursensor die linkshandige Z-vorm nucleïnezuren herkent, waaronder dubbelstrengs RNA in de Z-conformatie (Z-RNA). Z-RNA-binding vindt plaats via twee Zα-domeinen die zich op het N-eindpunt van ZBP1 bevinden. Van Z-RNA dat zich ophoopt tijdens RNA- en DNA-virusinfectie wordt verondersteld ZBP1 7,8 direct te betrekken. Geactiveerd zbp1 rekruteert RIPK3 via zijn centrale RHIMs en induceert gereguleerde celdood, waaronder necroptose 9,10. Virussen hebben tal van ontsnappingsmechanismen aangenomen om ZBP1-geïnduceerde gastheercelnederroptose tegen te gaan11. Bijvoorbeeld, het herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonucleotide reductase subunit 1, bekend als ICP6 en gecodeerd door UL39, herbergt RHIM op zijn N-terminus dat interfereert met ZBP1-gemedieerde RIPK3-activering in menselijke cellen 12,13,14,15. ZBP1 beperkt niet alleen virale replicatie, maar muisstudies hebben aangetoond dat ZBP1-activering ontstekingsziekten veroorzaakt en kankerimmuniteit stimuleert 16,17,18,19,20,21. Protocollen die signaleringsgebeurtenissen detecteren die optreden tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose in menselijke cellen zijn daarom waardevol om de rol van ZBP1 in deze processen te beoordelen.
Tyramide signaalversterking (TSA), ook wel katalyseerde reporter depositie (CARD) genoemd, is ontwikkeld om de detectiegrens en signaal-ruisverhouding in op antilichamen gebaseerde immunoassays te verbeteren. Tijdens TSA kan elk primair antilichaam worden gebruikt om het antigeen van belang te detecteren. Mierikswortelperoxidase (HRP), gekoppeld aan een secundair antilichaam, katalyseert de lokale opbouw van gebiotinyleerde tyramideradicalen in aanwezigheid van waterstofperoxide. Deze geactiveerde biotine-tyramideradicalen reageren vervolgens met proximale tyrosineresiduen om covalente bindingen te vormen. Potentiële tyramide-biotinesubstraten omvatten het antigeen zelf, de primaire en secundaire antilichamen en naburige eiwitten. Dus, terwijl TSA de gevoeligheid van de test aanzienlijk verbetert, gaat een deel van de ruimtelijke resolutie verloren. In een laatste stap worden biotinemoleculen gedetecteerd met behulp van fluorescerend gelabeld streptavidin. De HRP-reactie zet veel tyramide-biotinemoleculen af op of in de buurt van het antigeen van belang. Dit verhoogt het aantal streptavidin-fluorochrome bindingsplaatsen aanzienlijk, waardoor de gevoeligheid van de test aanzienlijk wordt versterkt (figuur 1). Als alternatief kan tyramide direct worden gekoppeld aan een fluorochroom, waardoor de noodzaak voor streptavidin-gekoppelde fluoroforen wordt geëlimineerd. Eiwitimmunohistochemie en DNA/RNA in situ hybridisatie behoorden tot de eerste methoden waarbij TSA werd gebruikt om de signaalintensiteiten te verbeteren22,23. Meer recent is TSA gecombineerd met intracellulaire flowcytometrie24 en massaspectrometrie25.
Hier presenteren we een protocol om serine 227 gefosforyleerde humane RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) en gefosforyleerde humane MLKL (p-MLKL [S358]) te detecteren bij de activering van ZBP1 door HSV-1-infectie met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. We gebruiken een necroptose-gevoelige HT-29 menselijke colorectale adenocarcinoom cellijn die werd getransduceerd om stabiel menselijk ZBP1 tot expressie te brengen. Deze cellen werden geïnfecteerd met een HSV-1-stam die een mutant ICP6-eiwit (HSV-1 ICP6mutRHIM) tot expressie bracht waarin vier kernaminozuren binnen het virale RHIM (VQCG) werden vervangen door alanines (AAAA), waardoor de ICP6 niet in staat was om ZBP1-gemedieerde necroptose te blokkeren 13,14,15. Om het probleem van de lage signaal-ruisverhouding van de momenteel in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen p-RIPK3 en p-MLKL in immunostaining26 te overwinnen, voeren we een tyramide signaalversterking (TSA) stap uit (Figuur 1), die resulteert in de robuuste detectie van humane p-RIPK3 (S227) en de detectiegevoeligheid van menselijke p-MLKL (S358) met een orde van grootte verbetert.
Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal …
The authors have nothing to disclose.
We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG en GIGG consortia en VIB.
Antibodies | |||
Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
Fluorophores | |||
DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
Compounds | |||
30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
For cell culture: to detach the cells | |||
8.0 g/L NaCl | |||
0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
0.2 g/L NaH2PO4 | |||
0.2 g/L KCl | |||
0.2 g/L Glucose | |||
Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
PBS | Gibco | 10444402 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
Material | |||
µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
Software | |||
Excel | Office | xx | To process the data |
Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
Viruses | |||
HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |