Summary

茶サンプル中のピロリジジンアルカロイド汚染の発生源と経路

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

本プロトコルは、茶園のPA産生雑草からの茶サンプル中のピロリジジンアルカロイド(PA)の汚染について説明しています。

Abstract

有毒なピロリジジンアルカロイド(PA)はお茶のサンプルに含まれており、人間の健康に脅威をもたらします。しかし、茶サンプル中のPA汚染の原因と経路は不明のままです。本研究では、UPLC-MS/MSと組み合わせた吸着剤法を開発し、雑草Ageratum conyzoides L.、A. conyzoides 根粒球土壌、新鮮な茶葉、および乾燥茶サンプル中の15のPAを測定しました。平均回収率は78%〜111%の範囲であり、相対標準偏差は0.33%〜14.8%であった。中国安徽省の金寨茶園から15組のコゾイデスとコニゾイデスの根圏土壌サンプル60枚を採取し、15個のPAについて分析しました。インターメジン-N-オキシド(ImNO)とセネシオニン(Sn)を除いて、15のPAすべてが新鮮な茶葉で検出されたわけではありません。ImNO(34.7μg/kg)の含有量はSn(9.69μg/kg)よりも多かった。また,ImNOとSnはいずれも茶樹の若葉に集中していたが,その含有量は古い葉では低かった。その結果,茶園ではPA生成雑草-土壌-生茶葉の経路を通って茶類中のPAが移動することが示された。

Introduction

二次代謝産物として、ピロリジジンアルカロイド(PA)は草食動物、昆虫、および病原体から植物を保護します1,2。これまでに、異なる構造を持つ660を超えるPAおよびPA-N酸化物(PANO)が、世界中の6,000を超える植物種で発見されています3,4。PA生産植物は、主にキク科、ボラギナ科、ブナ科、およびキク科5,6に見られます。PAは不安定なデヒドロピロリジジンアルカロイドに容易に酸化され、強い求電子性を持ち、DNAやタンパク質などの求核剤を攻撃し、肝細胞の壊死、静脈閉塞、肝硬変、腹水、およびその他の症状を引き起こす可能性があります7,8。PA毒性の主な標的器官は肝臓です。PAはまた、肺、腎臓、およびその他の臓器毒性および変異原性、発がん性、および発生毒性を引き起こす可能性があります9,10

PAを含む伝統的なハーブ、サプリメント、お茶の摂取、または牛乳、蜂蜜、肉などの食品の間接的な汚染(PAを含む放牧の摂取による毒性)から、人間と動物の中毒の症例が多くの国で報告されています11,12,13。欧州食品安全機関(EFSA)の調査結果は、(ハーブ)ティーなどの物質がPA / PANOへの人間の曝露の重要な原因であることを示しています14。茶サンプルはPAを生成しませんが、PA産生植物は茶園で一般的に見られます(例:エミリアソンチフォリアセネシオアングラタスおよびアゲラタムコニゾイデス)15。以前は、お茶がピッキングおよび加工中に生産工場からのPAで汚染されている可能性があると疑われていました。しかし、PAはいくつかの手摘み茶葉(すなわち、PA生産プラントがない)でも検出され、他の経路または汚染源があるに違いないことを示唆しています16。ラグワート(セネシオ・ジャコバエア)とメリッサ(メリッサ・オフィシナリス)、ペパーミント(ハッカ・ピペリタ)、パセリ(ペトロセリナム・クリスプム)、カモミール(マトリカリア・レキューティタ)、キンレンカ(トロパエオラム・マジュス)の共栽培実験を行い、その結果、これらすべての植物でPAが検出されました17。PAは実際に土壌18,19を介して生きている植物間で移動および交換されることが確認されています。Van Wykら20は、ルイボスティー(Aspalathus linearis)が雑草が豊富な場所でひどく汚染されており、同じ種類と比率のPAを含んでいることを発見しました。しかし、雑草のない場所のルイボスティーからPAは検出されませんでした。

現在、高い選択性と感度を備えた超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC-MS / MS)は、農産物および食品中のPAの定性的および定量的分析に広く使用されています21,22。サンプル処理方法は通常、固相抽出(SPE)または複雑な食品マトリックス抽出物のQuEChERS(クイックイージーで安価で効果的な頑丈な安全)クリーンアップのいずれかで構成され、可能な限り最高の感度を得ることができます12,19。しかし、土壌、雑草、新鮮な茶葉などの複雑なマトリックス中のPAの検出と定量を可能にする堅牢な分析方法はまだ不足しています。

本研究では、乾燥茶試料、生茶葉、雑草、雑草根圏土壌試料中の15種類のPAを、UPLC-MS/MSと吸着剤精製法を組み合わせて分析した。さらに、中国安徽省金寨茶園の5つのサンプリングサイトから15対の雑草および雑草根圏土壌サンプル15ペアと60生茶葉サンプルを収集し、15のPAについて分析しました。これらの結果は、お茶の品質と安全性を確保するために、お茶のサンプル中のPA(汚染)の発生源と経路に関する調査方法といくつかの情報を提供することができます。

Protocol

本研究では、次の雑草種が収集されました:Ludwigia prostrata Roxb.、Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke)Bruckn.、Ageratum conyzoides L.、Chenopodium ambrosioides、Trachelospermum jasminoide(L.) Lem.、Ageratum conyzoides L.、Emilia sonchifolia (L.) DC、Ageratum conyzoides L.、およびCrassocephalum crepidioides (ベンス)S.ムーア。生茶葉は龍井43#茶樹の品種から摘み取られ、乾?…

Representative Results

乾燥茶試料、生茶葉、雑草、土壌中の15 PAの最適化された吸着剤精製および分析方法を確立し、SPEカートリッジを使用した一般的に使用されている精製方法と比較しました。その結果、SPEカートリッジを使用した乾燥茶サンプル、雑草、および新鮮な茶葉中の15のPAの回収率は72%〜120%であり、吸着剤精製を使用した場合の回収率は78%〜98%でした(図1)。吸着剤精製を用いた…

Discussion

本研究は、茶類試料中のPAの汚染経路と発生源、および茶樹のさまざまな部分におけるPAの分布を探索するための効果的で高感度な方法を開発するために設計されました。しかし、この研究では、クロマトグラフィーカラムで正常に分離されたPAは15個のみであり、植物種のアルカロイドの数が多いのに比べて非常に少ない数です3,4。これは、カラム…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(32102244)、国家農産物の品質と安全性およびリスク評価プロジェクト(GJFP2021001)、安徽省自然科学財団(19252002)、およびUSDA(HAW05020H)の支援を受けました。

Materials

Acetonitrile (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115197 CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 181210 CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%) Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) G0860050 CAS No:540-69-2
Carbon-GCB CNW B7760030 120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HK HERMLE Z36HK 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun loose tea Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) BioCrick 323256 CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%) BioCrick 98222 CAS No:570-19-4
Formate (98.0%) Aladdin E2022005 CAS No:64-18-6
HC-C18 CNW D2110060 40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%) BioCrick 906426 CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) BioCrick 22581 CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS cence 203158000 Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column Waters 186004976 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%) BioCrick 114843 CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) BioCrick 340066 CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%) BioCrick 132282048 CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) ChemFaces CFN00461 CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115100 CAS No:67-56-1
PSA Agela P19-00833 40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%) BioCrick 5281743 CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) BioCrick 5281734 CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%) BioCrick 5280906 CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) BioCrick 5380876 CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) BioCrick 6442619 CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%) BioCrick 5281750 CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%) BioCrick 5281752 CAS No:2318-18-5
SPE PCX Agilent Technologies 12108206 Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019 CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20121009 CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner Supmile KQ-600B Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS Waters ZPLYY-003 Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator Guoyu instrument SHY-2AHS Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

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Cite This Article
Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu, L., Li, Q. X., Wang, C., Chen, H., Hua, R., Wu, X. Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples. J. Vis. Exp. (187), e64375, doi:10.3791/64375 (2022).

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