In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.
Cellen kunnen actief hun vorm veranderen en beweeglijk worden, een eigenschap die afhangt van hun vermogen om hun interne structuur actief te reorganiseren. Dit kenmerk wordt toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemotoren en accessoire eiwitten die intrinsieke contractie-eigenschappen vertonen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal. Dit model kan echter niet altijd de experimentele resultaten verklaren, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft als een poro-elastisch actief materiaal – een elastisch netwerk ingebed met cytosol. Contractiliteitsgradiënten gegenereerd door de myosinemotoren drijven de stroom van het cytosol door de gelporiën, wat afleidt dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn. Een belangrijk kenmerk van poro-elasticiteit is de diffusieve ontspanning van spanningen in het netwerk, gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante die afhankelijk is van de gelelastische modulus, porositeit en cytosol (oplosmiddel) viscositeit. Omdat cellen veel manieren hebben om hun structuur en materiaaleigenschappen te reguleren, blijft ons huidige begrip van hoe cytoskeletmechanica en cytosolstroomdynamiek zijn gekoppeld, slecht begrepen. Hier wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de materiaaleigenschappen van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem voor het celcytoskelet. Gelcontractie wordt aangedreven door myosine motorische contractiliteit, wat leidt tot het ontstaan van een stroom van het penetrerende oplosmiddel. Het artikel beschrijft hoe deze gels te bereiden en experimenten uit te voeren. We bespreken ook hoe de oplosmiddelstroom en gelcontractie kunnen worden gemeten en geanalyseerd, zowel op lokale als op wereldwijde schaal. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor gegevenskwantificering worden gegeven. Ten slotte worden de experimentele uitdagingen en veelvoorkomende valkuilen besproken, inclusief hun relevantie voor de cytoskeletmechanica van cellen.
Levende cellen hebben unieke mechanische eigenschappen. Naast het vermogen om passief te reageren op toegepaste krachten, zijn ze ook in staat om actief krachten te genereren als reactie op externe stimuli1. Deze kenmerken, die essentieel zijn voor een verscheidenheid aan cellulaire processen, met name tijdens celmotiliteit, worden voornamelijk toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemoleculaire motoren en accessoire-eiwitten. Deze actomyosinenetwerken vertonen intrinsieke zelforganisatie- en contractie-eigenschappen aangedreven door de myosinemotoreiwitten, die de actinefilamenten met elkaar verbinden en actief mechanische spanningen genereren in het netwerk dat wordt gevoed door ATP-hydrolyse2.
Talrijke experimentele en theoretische studies zijn uitgevoerd om de materiaaleigenschappen van het cytoskelet3 te bestuderen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal4. Dit betekent dat op korte tijdschalen het cytoskelet zich gedraagt als een elastisch materiaal en op lange tijdschalen gedraagt het zich als een viskeuze vloeistof vanwege de crosslinking-eiwitten en myosinemotorische loslating (en herbevestiging), waardoor het netwerk dynamisch kan omslaan. In veel situaties kan het visco-elastische model echter niet de experimentele resultaten beschrijven, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft en, meer in het algemeen, het celcytoplasma dat wordt beschreven als een poro-elastisch actief materiaal 5,6. Twee hoofdkenmerken kenmerken dit soort materialen. (i) Het eerste hoofdkenmerk is het genereren van een stroom van het doordringende cytosol (het “oplosmiddel”) over de gelporiën door contractiliteitsgradiënten aangedreven door de myosinemotoren, die ten grondslag liggen aan processen zoals cel blebbing7, motiliteit8 en celvormoscillaties9. De opkomst van dergelijke cytosolische stromen kan lokaal zijn, voor blebbing, of globaal, zoals in celmotiliteit. In het laatste geval drijven de contractiel aangebrachte spanningen aan de achterkant van de cel de stroom van de cytosolische vloeistof naar de voorkant van de cel, die de eiwitpool aanvult die nodig is voor lamellipodia-assemblage8. (ii) Het tweede hoofdkenmerk is dat de ontspanning van spanningen diffuus is en wordt gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante, , die afhankelijk is van de gelelastische modulus, gelporositeit en oplosmiddelviscositeit5. De poro-elastische diffusieconstante bepaalt hoe snel het systeem reageert op een toegepaste spanning. Hogere diffusieconstanten komen overeen met een snellere herverdeling van de spanning. Dit bepaalt op zijn beurt hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytosolische vloeistof binnen de cel wordt herverdeeld na toegepaste mechanische stress, hetzij extern of intern, zoals de actieve contractiele spanningen die worden gegenereerd door myosinemotoren. Deze voorbeelden tonen dus aan dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn en niet afzonderlijk kunnen worden behandeld3.
Omdat cellen hun mechanische eigenschappen op verschillende manieren kunnen reguleren, blijft het samenspel tussen netwerkmechanica en vloeistofstroomdynamica slecht begrepen. Een krachtige alternatieve benadering is het gebruik van in vitro gereconstitueerde systemen die volledige controle over de verschillende microscopische bestanddelen en de systeemparameters mogelijk maken, waardoor deze modelsystemen optimaal zijn voor fysische analyse10,11. Deze aanpak is met succes gebruikt om de impact van eiwitsamenstelling en systeemgeometrie op actine-gebaseerde motiliteit 12,13,14,15,16,17,18 te bestuderen, de 2D-patronen van actomyosinenetwerken 19,20,21,22, en de wisselwerking tussen netwerkcontractiliteit en vloeistofstroomdynamica van poro-elastische actomyosinegels, waar dit artikel zich op richt23.
In dit manuscript wordt de voorbereiding van contractiele elastische actomyosinenetwerken van controleerbare dimensies en materiaaleigenschappen besproken op basis van het werk van Ideses et al.23. De dynamiek van de samentrekkende gel en het gedraineerde oplosmiddel worden geanalyseerd en gekwantificeerd, waardoor wordt aangetoond dat deze actomyosine-gels kunnen worden beschreven als een poro-elastisch actief materiaal. Het bestuderen van het effect van oplosmiddelviscositeit op spanningsdiffusiviteit bevestigt verder de poro-elastische aard van deze netwerken. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor de kwantificering van gegevens worden verstrekt. Tot slot worden ook de experimentele uitdagingen, de veelvoorkomende valkuilen en de relevantie van de experimentele resultaten voor het celcytoskelet besproken.
Hier wordt een in vitro benadering gebruikt om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet en, meer in het algemeen, van het celcytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch materiaal 3,5. De reologie van het celcytoskelet (cytoplasma) is gekenmerkt door een poro-elastische diffusieconstante, die dicteert hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytoso…
The authors have nothing to disclose.
We willen Dina Aranovich bedanken voor de eiwitzuivering en etikettering. G.L. is het Israëlische ministerie van Wetenschap, Technologie en Ruimte dankbaar voor de Jabotinsky PhD Scholarship. A.B.G. is de Israel Science Foundation (subsidie 2101/20) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie – Staat Israël (subsidie 3-17491) dankbaar voor financiële steun.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |