La mécanique des réseaux d’actomyosine contractile (poro-)élastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire
Summary
Dans ce travail, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour étudier la poroélasticité des gels d’actomyosine dans des conditions contrôlées. La dynamique du gel d’actomyosine et du solvant incorporé est quantifiée, grâce à laquelle la poroélasticité du réseau est démontrée. Nous discutons également des défis expérimentaux, des pièges courants et de la pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.
Abstract
Les cellules peuvent changer activement leurs formes et devenir mobiles, une propriété qui dépend de leur capacité à réorganiser activement leur structure interne. Cette caractéristique est attribuée aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, notamment le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs de myosine et de protéines accessoires qui présentent des propriétés de contraction intrinsèques. L’opinion généralement acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique. Cependant, ce modèle ne peut pas toujours expliquer les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette comme une matière active poroélastique – un réseau élastique incorporé avec le cytosol. Les gradients de contractilité générés par les moteurs de myosine entraînent le flux du cytosol à travers les pores du gel, ce qui implique que la mécanique du cytosquelette et du cytosol est étroitement couplée. L’une des principales caractéristiques de la poroélasticité est la relaxation diffusive des contraintes dans le réseau, caractérisée par une constante de diffusion efficace qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité et de la viscosité du cytosol (solvant). Comme les cellules ont de nombreuses façons de réguler leur structure et leurs propriétés matérielles, notre compréhension actuelle de la façon dont la mécanique du cytosquelette et la dynamique de l’écoulement du cytosol sont couplées reste mal comprise. Ici, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour caractériser les propriétés matérielles des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle pour le cytosquelette cellulaire. La contraction du gel est entraînée par la contractilité motrice de la myosine, ce qui conduit à l’émergence d’un écoulement du solvant pénétrant. L’article décrit comment préparer ces gels et mener des expériences. Nous discutons également de la façon de mesurer et d’analyser le flux de solvant et la contraction du gel à l’échelle locale et mondiale. Les différentes relations d’échelle utilisées pour la quantification des données sont données. Enfin, les défis expérimentaux et les pièges courants sont discutés, y compris leur pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.
Introduction
Les cellules vivantes ont des propriétés mécaniques uniques. Outre la capacité de réagir passivement aux forces appliquées, ils sont également capables de générer activement des forces en réponse à des stimuli externes1. Ces caractéristiques, essentielles pour une variété de processus cellulaires, notamment lors de la motilité cellulaire, sont principalement attribuées aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, en particulier le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs moléculaires de myosine et de protéines accessoires. Ces réseaux d’actomyosine présentent des propriétés intrinsèques d’auto-organisation et de contraction entraînées par les protéines motrices de la myosine, qui réticulent les filaments d’actine et génèrent activement des contraintes mécaniques dans le réseau alimentées par l’hydrolyse de l’ATP2.
De nombreuses études expérimentales et théoriques ont été menées pour étudier les propriétés matérielles du cytosquelette3. L’opinion communément acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique4. Cela signifie que sur de courtes échelles de temps, le cytosquelette se comporte comme un matériau élastique, et sur de longues échelles de temps, il se comporte comme un fluide visqueux en raison des protéines de réticulation et du détachement moteur de la myosine (et du rattachement), ce qui permet au réseau de se renouveler dynamiquement. Dans de nombreuses situations, cependant, le modèle viscoélastique ne peut pas décrire les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette et, plus généralement, le cytoplasme cellulaire décrit comme une matière active poroélastique 5,6. Deux caractéristiques principales caractérisent ces types de matériaux. (i) La première caractéristique principale est la génération d’un flux du cytosol pénétrant (le « solvant ») à travers les pores du gel par des gradients de contractilité entraînés par les moteurs de myosine, qui sous-tend des processus tels que le blebbingcellulaire 7, la motilité8 et les oscillations de forme cellulaire9. L’émergence de tels flux cytosoliques peut être locale, pour le blebbing, ou globale, comme dans la motilité cellulaire. Dans ce dernier cas, les contraintes contractiles appliquées à l’arrière de la cellule entraînent le flux du liquide cytosolique vers le front cellulaire, ce qui reconstitue le pool protéique nécessaire à l’assemblage des lamellipodes8. (ii) La deuxième caractéristique principale est que la relaxation des contraintes est diffusive et se caractérise par une constante de diffusion effective, qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité du gel et de la viscositédu solvant 5. La constante de diffusion poroélastique détermine la vitesse à laquelle le système répond à une contrainte appliquée. Des constantes de diffusion plus élevées correspondent à une redistribution des contraintes plus rapide. Ceci, à son tour, détermine combien de temps il faut pour que le liquide cytosolique intracellulaire soit redistribué dans la cellule après une contrainte mécanique appliquée, qu’elle soit externe ou interne, comme les contraintes contractiles actives générées par les moteurs de myosine. Ces exemples démontrent ainsi que la mécanique du cytosquelette et du cytosol sont étroitement couplées et ne peuvent être traitées séparément3.
Comme les cellules peuvent réguler leurs propriétés mécaniques de diverses manières, l’interaction entre la mécanique des réseaux et la dynamique de l’écoulement des fluides reste mal comprise. Une approche alternative puissante consiste à utiliser des systèmes reconstitués in vitro qui permettent un contrôle total des divers constituants microscopiques et des paramètres du système, ce qui rend ces systèmes modèles optimaux pour l’analyse physique10,11. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’impact de la composition des protéines et de la géométrie du système sur la motilité à base d’actine 12,13,14,15,16,17,18, la structuration 2D des réseaux d’actomyosine 19,20,21,22, et l’interaction entre la contractilité du réseau et la dynamique de l’écoulement des fluides des gels d’actomyosine poroélastiques, qui fait l’objet de cet article23.
Dans ce manuscrit, la préparation de réseaux d’actomyosine élastique contractile de dimensions contrôlables et de propriétés matérielles est discutée sur la base des travaux d’Ideses et al.23. La dynamique du gel contractant et du solvant drainé est analysée et quantifiée, à travers laquelle il est démontré que ces gels d’actomyosine peuvent être décrits comme un matériau actif poroélastique. L’étude de l’effet de la viscosité des solvants sur la diffusivité des contraintes confirme encore le caractère poroélastique de ces réseaux. Les différentes relations de mise à l’échelle utilisées pour la quantification des données sont fournies. Enfin, les défis expérimentaux, les pièges courants et la pertinence des résultats expérimentaux pour le cytosquelette cellulaire sont également abordés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une approche in vitro est utilisée pour caractériser la mécanique des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire et, plus généralement, du cytoplasme cellulaire, dont il a été démontré qu’il se comporte comme un matériau poroélastique 3,5. La rhéologie du cytosquelette cellulaire (cytoplasme) a été caractérisée par une constante de diffusion poroélastique, qui dicte combien de temp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Dina Aranovich pour la purification et l’étiquetage des protéines. G.L. est reconnaissant au ministère israélien de la Science, de la Technologie et de l’Espace pour la bourse de doctorat Jabotinsky. A.B.G. remercie la Fondation israélienne pour la science (subvention 2101/20) et le ministère de la Science et de la Technologie de l’État d’Israël (subvention 3-17491) pour leur soutien financier.
Materials
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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