Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Summary

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Abstract

Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) para el glioblastoma multiforme humano (GBM) son fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de los tumores cerebrales. A diferencia de los tumores de xenoinjerto, en los GEM, los tumores surgen en el microambiente nativo en un ratón inmunocompetente. Sin embargo, el uso de GBM GEM en estudios de tratamiento preclínico es un desafío debido a las largas latencias tumorales, la heterogeneidad en la frecuencia de las neoplasias y el momento del desarrollo del tumor de grado avanzado. Los ratones inducidos a través de la inyección ortotópica intracraneal son más tratables para estudios preclínicos y conservan las características de los tumores GEM. Generamos un modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de un modelo GEM con aberraciones Rb, Kras y p53 (TRP), que desarrolla tumores GBM que muestran focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa análoga al GBM humano. Las células derivadas de tumores GEM GBM se inyectan intracranealmente en ratones receptores de tipo salvaje y reproducen tumores de grado IV, evitando así el largo período de latencia tumoral en ratones GEM y permitiendo la creación de cohortes grandes y reproducibles para estudios preclínicos. Las características altamente proliferativas, invasivas y vasculares del modelo TRP GEM para GBM se recapitulan en los tumores ortotópicos, y los marcadores histopatológicos reflejan subgrupos de GBM humanos. El crecimiento del tumor se controla mediante resonancias magnéticas seriadas. Debido a la naturaleza invasiva de los tumores intracraneales en modelos inmunocompetentes, seguir cuidadosamente el procedimiento de inyección descrito aquí es esencial para prevenir el crecimiento de tumores extracraneales.

Introduction

El glioblastoma (GBM; glioma grado IV) es el tumor cerebral más común y maligno, y las terapias actuales son ineficaces, lo que resulta en una mediana de supervivencia de 15 meses¹. Los modelos preclínicos confiables y precisos que representan las complejas vías de señalización involucradas en el crecimiento y la patogénesis del tumor cerebral son esenciales para acelerar el progreso en la evaluación de nuevos regímenes terapéuticos para GBM. Los modelos de ratón en los que las líneas celulares de tumores cerebrales humanos se implantan por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos no reflejan el entorno inmune nativo de los tumores cerebrales, ni pueden usarse para evaluar la capacidad de la terapéutica para cruzar la barrera hematoencefálica². Idealmente, los modelos preclínicos de ratón también deberían reproducir de cerca la histopatología del GBM humano, incluido el alto nivel de invasividad en el parénquima circundante³. Aunque los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) desarrollan tumores en el contexto de un sistema inmune intacto, a menudo se requieren esquemas de reproducción complicados, y los tumores pueden desarrollarse lenta e inconsistentemente⁴. Los modelos de aloinjertos derivados de GEM son más adecuados para estudios terapéuticos preclínicos, donde se necesitan grandes cohortes de ratones portadores de tumores en un período de tiempo más corto.

En un informe anterior, describimos un modelo ortotópico de ratón GBM derivado directamente de tumores GEM. La tumorigénesis en el GEM se inicia por eventos genéticos en poblaciones celulares (principalmente astrocitos) que expresan proteína ácida fibrilar glial (GFAP), que resultan en progresión a GBM. Estos TRP GEM albergan un transgén TgGZT121 (T), que expresa T121 después de la exposición a la recombinasa Cre impulsada por GFAP. La expresión de la proteína T121 da como resultado la supresión de la actividad de la proteína Rb (Rb1, p107 y p103). La coexpresión de un transgén Cre impulsado por GFAP (GFAP-CreERT2) dirige la expresión a los astrocitos adultos después de la inducción con tamoxifeno. Los ratones TRP también albergan un Kras mutante dependiente de Cre (Kras^G12D; R) alelos, para representar la activación de la vía de la tirosina quinasa receptora, y son heterocigotos para la pérdida de Pten(P)^5,6. Las aberraciones genéticas concurrentes en las redes receptoras tirosina quinasa (RTK), PI3K y RB están implicadas en el 74% de la patogénesis del GBM⁷. Por lo tanto, las vías de señalización primarias alteradas en el GBM humano están representadas por las mutaciones modificadas en ratones TRP, en particular tumores GBM, en los que se activan objetivos descendentes compartidos de RTK⁵.

El modelo ortotópico singénico derivado de GEM se validó como un modelo que recapitula las características de los tumores cerebrales humanos, incluida la invasividad y la presencia de biomarcadores de subtipo, para su uso como plataforma para evaluar la terapéutica del cáncer dirigida a vías aberrantes en GBM. Las células se cultivaron a partir de tumores cosechados de cerebros TRP y se reimplantaron en el cerebro de ratones de cepa compatible, utilizando equipos estereotácticos para la inyección intracraneal en la corteza. Este modelo ortotópico preclínico de ratón desarrolló tumores GBM que eran altamente celulares, invasivos, pleomórficos con una alta tasa mitótica y mostraban focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa, como se observa para el GBM humano. Los volúmenes y el crecimiento tumoral se midieron mediante imágenes de resonancia magnética (RM) in vivo .

En este informe, describimos la técnica óptima para la inyección intracraneal de células GBM primarias o líneas celulares en el cerebro de ratón de tipo salvaje, utilizando tumores TRP como ejemplo. El mismo protocolo puede adaptarse para ratones inmunocomprometidos y otras líneas celulares GBM. Se dan consejos cruciales para evitar errores comunes, como la preparación de células subóptimas o fugas de células en el lugar de inyección, y para usar correctamente el equipo estereotáctico para garantizar la reproducibilidad y confiabilidad del modelo. Para fines traslacionales, validamos el modelo mediante la detección por resonancia magnética del crecimiento de tumores cerebrales en animales vivos, la caracterización histológica y presentamos un ejemplo de tratamiento en ratones portadores de tumores.

Protocol

El protocolo del estudio descrito aquí fue aprobado por el NCI en el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Frederick. NCI-Frederick está acreditado por AAALAC International y sigue la Política del Servicio de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El cuidado de los animales se proporcionó de acuerdo con los procedimientos descritos en la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio” (Consejo Nacional de Investigación, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.). <p…

Representative Results

Los ratones inyectados con células tumorales cerebrales deben ser monitoreados diariamente para detectar signos de crecimiento tumoral, como convulsiones, ataxia o pérdida de peso. El crecimiento del tumor cerebral también se puede controlar mediante una resonancia magnética a intervalos regulares. Las resonancias magnéticas semanales permiten visualizar el aumento de la carga tumoral dentro del cerebro y las mediciones del volumen tumoral (Figura 1C). En particular, los tumores TRP exh…

Discussion

Los modelos preclínicos son esenciales para la evaluación de nuevas dianas terapéuticas y nuevas estrategias de tratamiento en GBM. Los modelos de ratón genéticamente modificados para GBM tienen la ventaja de la aparición de tumores en el sitio autóctono, pero a menudo con una latencia larga y un crecimiento tumoral impredecible¹³. Los tumores modelo GEM exhiben una latencia de 4-5 meses, y la ventana de tiempo ideal para la obtención de imágenes, el reclutamiento y el tratamiento es vari…

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T