neuroHuMiX is een geavanceerd darm-op-een-chip-model om de interacties van bacteriële, epitheel- en neuronale cellen te bestuderen onder proximale en representatieve co-cultuuromstandigheden. Dit model maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de communicatie tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel.
Het menselijk lichaam wordt gekoloniseerd door minstens hetzelfde aantal microbiële cellen als het is samengesteld uit menselijke cellen, en de meeste van deze micro-organismen bevinden zich in de darm. Hoewel de wisselwerking tussen het darmmicrobioom en de gastheer uitgebreid is bestudeerd, blijft de interactie tussen het darmmicrobioom en het enterische zenuwstelsel grotendeels onbekend. Tot op heden bestaat er geen fysiologisch representatief in vitro model om de interacties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen.
Om deze leemte op te vullen, hebben we het humaan-microbiële overspraak (HuMiX) darm-op-chip-model verder ontwikkeld door geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide enterische neuronen in het apparaat te introduceren. Het resulterende model, ‘neuroHuMiX’, maakt het mogelijk om bacteriële, epitheel- en neuronale cellen samen te kweken via microfluïdische kanalen, gescheiden door semi-permeabele membranen. Ondanks de scheiding van de verschillende celtypen, kunnen de cellen met elkaar communiceren door middel van oplosbare factoren, waardoor tegelijkertijd de mogelijkheid wordt geboden om elk celtype afzonderlijk te bestuderen. Deze opstelling geeft de eerste inzichten in hoe het darmmicrobioom de enterische neuronale cellen beïnvloedt. Dit is een cruciale eerste stap in het bestuderen en begrijpen van de as van het menselijke darmmicrobioom-zenuwstelsel.
Het menselijke darmmicrobioom speelt een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Het is de afgelopen vijftien jaar uitgebreid bestudeerd en de potentiële rol ervan bij het moduleren van gezondheid en ziekte is nu vastgesteld1. Er is verondersteld dat een verstoring van het microbioom die leidt tot een onevenwichtige microbiële gemeenschap (dysbiose) betrokken is bij de pathogenese van veel chronische aandoeningen, zoals obesitas, inflammatoire darmaandoeningen en colorectale kanker, of zelfs neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson 2,3.
Hoewel het menselijke darmmicrobioom in verband is gebracht met neurologische aandoeningen, is het nog steeds onduidelijk hoe het darmmicrobioom communiceert met en invloed heeft op het enterische zenuwstelsel. Omdat het menselijk enterisch zenuwstelsel niet gemakkelijk toegankelijk is voor onmiddellijke studie, zijn tot nu toe diermodellen gebruikt in experimenten4. Gezien de schijnbare verschillen tussen diermodellen en mensen5, is de ontwikkeling van in vitro modellen die de menselijke darm nabootsen echter van onmiddellijk belang. In deze context heeft het ontluikende en voortschrijdende veld van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) ons in staat gesteld representatieve enterische neuronen (EN’s) te verkrijgen6. iPSC-afgeleide EN’s maken het mogelijk om het enterische zenuwstelsel te bestuderen in in vitro kweekmodellen, zoals celkweekinserts, organoïden of organen-op-een-chip 7,8.
Het humaan-microbiële overspraakmodel (HuMiX) is een darm-op-een-chip-model dat de menselijke darm nabootst9. Het oorspronkelijke HuMiX-model (hierna het initiële apparaat genoemd) bood plaats aan epitheelcellen (Caco-2) en bacteriële cellen10,11. Om de link tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen, zijn echter ook van iPSC afgeleide EN’s6 in het systeem geïntroduceerd (Figuur 1). De proximale co-cultuur van neuronale, epitheliale en bacteriële cellen maakt het mogelijk om de verschillende celtypen afzonderlijk te analyseren en de interacties tussen de verschillende celtypen te bestuderen in een omgeving die die van de menselijke darm nabootst.
In de afgelopen jaren is er vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van modellen om organen op meer fysiologisch representatieve manieren te bestuderen door gebruik te maken van organen-op-een-chip (bijv. darm-op-een-chip) modellen. Deze modellen zijn meer representatief voor het menselijke darmmilieu vanwege de constante toevoer van voedingsstoffen en afvalverwijdering, evenals real-time monitoring van bijvoorbeeld zuurstofniveaus of barrière-integriteit 8,12. Deze modellen maken het specifiek mogelijk om de effecten van darmbacteriën op gastheercellen te bestuderen. Om organen-op-een-chip te kunnen gebruiken om de onderlinge relaties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen, moeten neuronale cellen echter in dergelijke systemen worden geïntegreerd. Daarom was het doel van de verdere ontwikkeling van HuMiX en het opzetten van het neuroHuMiX-systeem (hierna het apparaat genoemd) het ontwikkelen van een darm-op-een-chip-model, dat enterische neuronale cellen omvat in proximale co-cultuur met darmepitheelcellen en bacteriën.
Het is nu vastgesteld dat het menselijke darmmicrobioom de gezondheid en ziekte van de gastheer beïnvloedt. Ondanks de kennis die het belang van ons microbioom suggereert, vooral bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson 3,13, blijft het grotendeels onbekend hoe het darmmicrobioom interageert met het enterische zenuwstelsel en vervolgens met de hersenen.
Een representatief model om de interacties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen was tot nu toe niet beschikbaar. Studies met betrekking tot de darm-hersenas worden traditioneel uitgevoerd met behulp van muizenmodellen13. Muizen en mensen delen 85% van hun genomische sequenties14, maar er zijn significante verschillen waarmee rekening moet worden gehouden bij het vergelijken van muizen met mensen. Wat de darm betreft, is het belangrijk op te merken dat muizen, in vergelijking met mensen, uitsluitend herbivoren zijn. Hierdoor verschilt hun maagdarmkanaal in lengte en kenmerken, zoals de ‘maaglediging’14. Muizenhersenen vertonen ook belangrijke verschillen, waarbij de algehele structuur tussen muizen en mensen anders is15. Belangrijk is dat mensen langere celcyclustijden hebben van neurale voorlopers15. Daarom is het belangrijk om representatieve modellen te ontwikkelen die van mensen afkomstige cellen omvatten, waaronder darm- en neuronale cellen5. In deze context vermindert de ontwikkeling van meer reproduceerbaar onderzoek via in-vitromodellen de noodzaak om diermodellen te gebruiken en verbetert de reproduceerbaarheid.
neuroHuMiX is een geavanceerde versie van het vorige HuMiX model9. HuMiX is een darm-op-een-chip-model dat proximale en representatieve co-culturen van epitheel- en bacteriële cellen mogelijk maakt. Cel-cel communicatie is mogelijk door de proximale co-cultuur en diffusie van uitgescheiden factoren en metabolieten via semipermeabele membranen. Om het nut van het oorspronkelijke apparaat om de menselijke darmomgeving te bestuderen uit te breiden, is echter de introductie van een extra celtype vereist. Om dit aan te pakken, maakt neuroHuMiX, ontwikkeld met de introductie van iPSC-afgeleide EN’s, een proximale co-cultuur van bacteriën, darmepitheelcellen en EN’s mogelijk. Het resulterende in-vitromodel stelt ons in staat om vragen te beantwoorden met betrekking tot het menselijke darmmicrobioom in relatie tot het menselijk zenuwstelsel. Het samen kweken van verschillende celtypen, met name co-culturen van zoogdiercellen en bacteriën, brengt verschillende uitdagingen met zich mee, waaronder het verlies van levensvatbaarheid, slechte hechting en algeheel verlies bij samenvloeiing16. Hier hebben we aangetoond dat we binnen dit apparaat in staat zijn om drie verschillende celtypen binnen hetzelfde systeem te co-cultureren en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cel hoog te houden.
Een cruciale stap in het protocol is om te zorgen voor samenvloeiing van de neuronale cellen – 80%-90% celsamenvloeiing en levensvatbaarheid – voordat ze in het apparaat worden geïnoculeerd. Aangezien het niet mogelijk is om de celgroei tijdens de run te beoordelen, is het van het grootste belang om ervoor te zorgen dat de cellen goed samenvloeien en groeien voordat ze in het model worden geïntroduceerd. Hoewel dit een beperkende factor kan zijn, is de algehele levensvatbaarheid en samenvloeiendheid die in het apparaat wordt waargenomen over het algemeen hoog.
Het apparaat is via slangen verbonden met een peristaltische pomp. Elke celkamer heeft zijn specifieke slanglijn. De slang bestaat uit een pompslang die het gebruik van een peristaltische pomp voor de perfusie van het medium mogelijk maakt, evenals een slang die de pompslang met het apparaat verbindt en een slang die het apparaat verbindt met de uitstroom-/afvalflessen. Voor en na het apparaat zijn bemonsteringspoorten opgenomen om de inoculatie en bemonstering van het uitstroommedium mogelijk te maken. Elke kamer kan worden aangesloten op een ander medium, waardoor de beste kweekomstandigheden voor elk afzonderlijk celtype mogelijk zijn. Elke kamer kan worden geopend of gesloten, afhankelijk van de specifieke behoeften aan mediumtoevoer. In het apparaat blijft de neuronale kamer het grootste deel van het experiment gesloten, terwijl de bacteriële en epitheelkamers de hele tijd open zijn, wat betekent dat ze gedurende de hele experimentele run vers medium krijgen. Om ervoor te zorgen dat het medium zonder onderbreking stroomt, is het van cruciaal belang dat er geen lucht in de slangen, connectoren of in het apparaat achterblijft. Daarom is het belangrijk om de apparaten eerst een paar minuten te laten draaien bij de aanzuigstap. Dit lost het probleem vaak op. Als dit niet het geval is, kan een van de andere lijnen die vallen voor een korte tijd worden gesloten door de driewegkraan van de uitstroom te sluiten. Hierdoor wordt het medium omgeleid naar de lijn met de luchtbel, waardoor het probleem wordt opgelost door de bel door de slang naar buiten te duwen.
Voor elk celkweekexperiment is het medium een belangrijk onderdeel, waarbij elk celtype zijn respectievelijke medium heeft. In een co-cultuuropstelling moet het medium niet alleen compatibel zijn met het celtype dat erin groeit, maar ook met de andere celtypen binnen de cocultuur. Dit is niet anders voor het apparaat, wat een extra uitdaging vormt omdat we drie verschillende compartimenten hebben met drie verschillende celtypen binnenin: bacteriële, epitheliale en neuronale cellen. We hebben echter aangetoond dat door het modificeren van de bacteriële media – met toevoeging van 5% MRS aan RPMI 1640 met 10% FBS – alle celtypen, in het bijzonder bacteriële en epitheelcellen, met succes kunnen worden gecocultureerd binnen het systeem. In het apparaat worden echter verschillende celtypen in de buurt samen gekweekt en staan ze dus niet in direct contact met elkaar. Hoewel dit niet volledig representatief is voor het directe contact tussen cellen in de menselijke darm, en dus een beperking, is de proximale en representatieve co-cultuurconditie een sterk punt voor stroomafwaartse analyses. Oplosbare factoren wisselen uit tussen de verschillende kamers en celtypen; vandaar dat de cellen nog steeds met elkaar in wisselwerking staan. Bovendien stelt het feit dat de celtypen afzonderlijk kunnen worden geoogst en geanalyseerd, ons in staat om het effect van een gezond en/of ziek microbioom op verschillende celtypen (inclusief neuronale cellen) te bestuderen en daarmee celtype-specifieke uitlezingen te bepalen/op te halen. Een andere beperking is dat de morfologie van de cellen niet kan worden opgevolgd tijdens de experimentele run, omdat het apparaat alleen aan het einde van elk experiment kan worden geopend en de cellen kunnen worden gecontroleerd.
Voor zover wij weten, is neuroHuMiX het eerste gut-on-a-chip-model dat EN’s bevat. Dit is een stap in de richting van het ophelderen van de communicatie tussen de darmmicrobiota en het enterische zenuwstelsel. Het is een model dat onderzoek mogelijk maakt naar de wisselwerking tussen een bacteriesoort, een epitheellaag en EN’s. Het ontwerp stelt ons in staat om de uitwisseling van oplosbare factoren die door de verschillende celtypen worden uitgescheiden en hun effect op elkaar te bestuderen. In de toekomst zou het belangrijk zijn om niet alleen iPSC-afgeleide EN’s te hebben, maar ook iPSC-afgeleide epitheelcellen in het apparaat, om het apparaat om te zetten in een gepersonaliseerd model. Belangrijk is dat dit gepersonaliseerde model kan worden gebruikt om pre-, pro- en synbiotica te testen 10,11 en mogelijk gepersonaliseerde screening- en therapeutische benaderingen te ontwikkelen17. Gepersonaliseerde neuroHuMiX zou uiteindelijk licht kunnen werpen op de ‘donkere materie’ van het menselijke darmmicrobioom en de interacties met het zenuwstelsel langs de as darmmicrobioom-zenuwstelsel, wat de weg vrijmaakt voor therapeutische beoordeling en interventies.
We kunnen concluderen dat het kunnen hebben van een darm-op-een-chip inclusief het enterische neuronale systeem cruciaal is voor vooruitgang in de studie en het begrip van interacties langs de as van het darmmicrobioom-zenuwstelsel. NeuroHuMiX stelt ons in staat om de effecten van bacteriesoorten op gastheercellen te bestuderen en geeft ons een goede basis om het model nog verder te verbeteren op een nog fysiologisch representatievere manier.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Dr. Jared Sterneckert bedanken voor het verstrekken van de cellen uit de K7-lijn. We willen ook de langdurige medewerkers Dr. Frederic Zenhausern en Matthew W. Barret van de Universiteit van Arizona bedanken voor hun hulp bij de technische aspecten. We willen ook Dr. Valentina Galata bedanken voor haar hulp bij het ontwerpen van de schematische weergave van neuroHuMiX. Dit project is gefinancierd door de European Research Council (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst 863664). Figuur 1 is gedeeltelijk gemaakt met Biorender.com.
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |