肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法
Summary
ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。
Abstract
組織由来の小さな細胞外小胞(sEV)は、ソース細胞の機能状態と組織の間質空間の特性を反映することができます。これらのsEVの効率的な濃縮は、それらの生物学的機能の研究にとって重要な前提条件であり、臨床検出技術と治療キャリア技術の開発の鍵です。sEVは通常ひどく汚染されているため、組織から分離することは困難です。この研究は、肝癌組織から高品質のsEVを迅速に濃縮する方法を提供します。この方法には、消化酵素(コラゲナーゼDおよびDNase Ι)と組織とのインキュベーション、70 μmセルストレーナーによるろ過、差動超遠心分離、および0.22 μmメンブレンフィルターによるろ過の4段階のプロセスが含まれます。差動超遠心分離ステップの最適化とろ過ステップの追加により、この方法で得られるsEVの純度は、従来の示差超遠心分離によって達成されるものよりも高くなります。これは、組織由来sEVの研究のための重要な方法論と裏付けとなるデータを提供します。
Introduction
小さな細胞外小胞(sEV)は、直径が約30 nmから150 nmで、さまざまな細胞から分泌されます1。それらは組織細胞と通信し、脂質、タンパク質、DNA、RNAなどの重要な生体分子をさまざまな臓器、組織、細胞、および細胞内部分に輸送することにより、局所または遠隔の微小環境を調節することができます。したがって、それらはまた、受信者セル2、3の挙動を変えることができる。特定のsEVの単離と精製は、病気の発症および経過中の生物学的挙動を研究するための不可欠な前提条件です。ゴールドスタンダードと見なされている差動超遠心分離は、sEVを通常存在する組織から分離するために一般的に使用されます4。組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、sEVのみを残してこの技術によって除去することができます。
コラゲナーゼDおよびDNaseIは、細胞または小胞の分子特性に影響を及ぼさないことが示されており、両方の酵素の特性が細胞外マトリックス5における小胞の放出に寄与する。これらの酵素は、ヒト転移性黒色腫組織、結腸癌組織、および結腸粘膜組織からsEVを抽出するために使用されています5、6、7。しかし、これらの方法におけるコラゲナーゼDとDNase Iの濃度と消化時間は異なり、一貫性のない結論につながります。他のサブタイプのsEVの共沈を避けるために、研究者はろ過および/または示差遠心分離によってより大きな細胞外小胞(直径0.1 μmまたは0.2 μm)を除去しました8。ソース組織に応じて、単離および精製の異なる方法が必要とされる場合がある9、10。
従来の差動超遠心分離法を使用して肝臓組織からsEVを抽出すると、上清の表面に白質の層が形成され、その特性を決定する方法はありません。以前の研究11では、この白質の層がsEVの純度に影響を与えることがわかりました。従来の方法で分離されたサンプルの粒子数とタンパク質濃度は現在の方法よりも高かったが、多くの汚染物質が結果の再現性を低下させる可能性があるため、変動係数は大きかった。すなわち、洗剤を用いて(すなわち、1%Triton X-100中の粒子の溶解度を検出する)と、この方法で得られたsEVの純度が高いことを見出した。そこで、この方法を用いて大腸がん組織由来のsEVを単離・精製し、プロテオミクス研究を行っています。
現在、肝臓がんにおけるsEVの研究は、主に血清、血漿、および細胞培養の上清に焦点を当てています12,13,14。しかし、肝臓がん組織由来のsEVは、肝臓がんの生理学的病理と周囲の微小環境をより正確に反映し、他のEVの劣化や汚染を効果的に回避することができます15,16。示差超遠心法を使用することで、この方法は収量を豊かにし、高品質のsEVを得ることができ、肝臓がんのさらなる研究のための重要な基礎を提供します。この方法により、肝癌組織を鋭利な分離により分離し、コラゲナーゼDおよびDNaseIによって解離させることができます。次いで、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、濾過および示差超遠心分離によってさらに除去される。最後に、sEVは後の研究のために分離および精製されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、肝臓癌組織からsEVを抽出するための再現性のある方法について説明しています。高品質のsEVは、鋭い組織分離、消化酵素による処理、差動超遠心分離、および0.22μmフィルター膜ろ過および精製によって得られます。ダウンストリーム分析では、sEVの高純度を確保することが非常に重要です。差動遠心分離の過程で、上清の表面に白い物質(未知の組成)の層が現れます。こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究を支援してくれた甘南医科大学第一付属病院に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82260422)の支援を受けました。
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
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