Summary

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Published: November 04, 2022
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Summary

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Abstract

Os neutrófilos funcionam como a primeira linha de defesa celular em uma resposta imune inata, empregando diversos mecanismos, como a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Este estudo analisa as alterações morfológicas e composicionais em TNEs induzidas por estímulos microbianos e químicos utilizando metodologias padronizadas in vitro para indução e caracterização da TNE com células humanas. Os procedimentos aqui descritos permitem a análise da morfologia da NET (lítica ou não lítica) e da composição (estruturas DNA-proteína e atividade enzimática), e o efeito de fatores solúveis ou contato celular sobre tais características. Além disso, as técnicas aqui descritas poderiam ser modificadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular na composição da TNE.

As técnicas aplicadas incluem a purificação de células polimorfonucleares do sangue periférico humano usando um gradiente de densidade dupla (1,079-1,098 g/mL), garantindo pureza e viabilidade ideais (≥ 95%), conforme demonstrado pela coloração de Wright, exclusão de azul de tripano e citometria de fluxo, incluindo análise FSC versus SSC e coloração 7AAD. A formação de NET é induzida com estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e químicos (acetato de miristato de phorbol, HOCl), e os TNEs são caracterizados por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para o peptídeo antimicrobiano catelicidina (LL37) e quantificação da atividade enzimática (elastase de neutrófilos, catepsina G e mieloperoxidase). As imagens são adquiridas por microscopia de fluorescência e analisadas com ImageJ.

Introduction

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares 1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear, seguidas de derramamento do nucleoplasma para o citoplasma, e um aumento na permeabilidade da membrana a partir de 3 h de incubação com acetato de miristato de forbol (PMA)2,3. No entanto, foi somente em 2004 que o termo “armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)” foi utilizado4.

A formação de NET tem sido observada em diversas condições, como infecções bacterianas, fúngicas5, virais6 e parasitárias, para neutralizar, matar e prevenir a disseminação microbiana7. Outros estudos mostram que também pode ocorrer em condições não patogênicas por estímulos estéreis, como citocinas, ácido úrico monossódico ou cristais de colesterol, autoanticorpos, imunocomplexos e plaquetas ativadas7. Lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-8 (IL-8) e PMA estavam entre os primeiros estímulos in vitro descritos como indutores de NET, e o envolvimento in vivo da TNE em processos patogênicos foi demonstrado em dois modelos de inflamação aguda: disenteria experimental e apendicite humana espontânea4. O DNA é um componente essencial da NET. Sua estrutura e composição adequadas são necessárias para o sequestro e morte de microrganismos, fornecendo uma alta concentração local de moléculas antimicrobianas em direção aos micróbios capturados, como demonstrado por um breve tratamento com desoxirribonuclease (DNase) que desintegra TNEs e suas propriedades microbicidas4. Além do DNA, os TNEs compreendem proteínas aderentes, como histonas, elastase de neutrófilos (NE), catepsina G (GC), proteinase 3, lactoferrina, gelatinase, mieloperoxidase (MPO) e peptídeos antimicrobianos (AMPs), como o peptídeo pró-inflamatório catiônico catelicidina LL-37, entre outros 8,9. Tais agregados podem formar roscas maiores com diâmetros de até 50 nm. Esses fatores podem perturbar os fatores de virulência microbiana ou a integridade da membrana celular do patógeno; além disso, os AMPs podem estabilizar o DNA derivado da TNE contra a degradação por nucleases bacterianas10.

Os mecanismos específicos que regulam a formação da NET ainda não foram completamente esclarecidos. A via mais bem caracterizada que leva à liberação de NET é através da sinalização ERK, que leva à ativação da NADPH oxidase e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como ao aumento do cálcio intracelular que desencadeia a ativação da via MPO. Este, por sua vez, transforma o peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso, ativando o NE por oxidação11,12. O NE é responsável por degradar os filamentos de actina do citoesqueleto para bloquear a fagocitose e translocá-los para o núcleo para processamento por clivagem proteolítica e desaminação por PAD4 que impulsionam a dessensibilização das fibras cromatinas, que se associam a proteínas granulográficas e citoplasmáticas, e são então liberadas extracelularmente7. Essas proteases incluem aquelas liberadas do complexo azurossomo dos grânulos azurófilos e outras proteases, como a catepsina G13.

Dependendo das alterações morfológicas nos neutrófilos, os TNEs são classificados em dois tipos: formação de TNE suicida ou lítica levando à morte celular4 e formação de TNE vital ou não lítica produzida por células viáveis mediadas por uma liberação vesicular de DNA nuclear ou mitocondrial, com remanescente de citoplasto anucleado com capacidade fagocítica14,15. Geralmente, TNEs compostos de DNA mitocondrial apresentam morfologia de fibra alongada14, enquanto aqueles estruturados de DNA nuclear têm aparência de nuvem3. No entanto, não se sabe como o neutrófilo escolhe sua origem no DNA. Ao contrário de estudos anteriores que descreveram as vias canônicas dos TNEs como exigindo várias horas, a via vital é rapidamente ativada em apenas 5-60 min15.

Apesar desses avanços, a composição da TNE varia de acordo com o estímulo; por exemplo, diferentes cepas mucoides e não mucoides de P. aeruginosa induzem a formação de TNEs contendo 33 proteínas comuns e até 50 proteínas variáveis7. Assim, faz-se necessário homogeneizar técnicas que permitam a geração de conclusões objetivas em grupos de pesquisa. Este trabalho descreve um protocolo com várias técnicas que permitem comparar e avaliar a composição, estrutura e morfologia de TNEs induzidos com diferentes microrganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-positiva), Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo), bem como estímulos químicos (PMA, HOCl) em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os resultados representativos demonstram a heterogeneidade dos TNEs dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis, caracterizadas por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para LL37 e quantificação da atividade enzimática (NE, GC e MPO).

Protocol

As amostras de sangue foram obtidas como doações de participantes clinicamente saudáveis após consentimento informado. Todos os experimentos foram realizados com a permissão do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. NOTA: Os critérios de inclusão no estudo foram sexo e idade indistintos e clinicamente saudáveis de acordo com as respostas dos participantes a um questionário antes de uma…

Representative Results

Pureza e viabilidade dos neutrófilosAs fases celulares dinâmicas são visualizadas no tubo a partir da purificação do gradiente de dupla densidade. Dentro dessas camadas, a camada correspondente aos granulócitos está acima da camada de densidade de 1,079 g/mL, distinta das fases de mononucleócitos do sangue periférico (PBMCs) e eritrócitos (Figura 1A). A morfologia das células purificadas foi verificada com a coloração de Wright por meio da observação de c?…

Discussion

Uma população altamente pura de neutrófilos viáveis deve ser obtida para induzir a liberação de TNEs, uma vez que essas células têm uma vida útil ex vivo limitada de 8 h em média, um período dentro do qual todos os experimentos devem ser realizados. Para tanto, a metodologia ideal é o gradiente de dupla densidade para otimizar o tempo de purificação, isolando células não ativadas mais responsivas à estimulação exógena, em contraste com o gradiente Ficoll-Histopaque ou as técnicas de sediment…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de ciência básica (#285480) do CONACyT e pelo Departamento de Pesquisa em Imunologia Clínica da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L e W.J.R.R. têm bolsas de doutorado dos números CONACyT #799779, #660793 e #827788, respectivamente.

Materials

24 Well plate for cell culture Corning  3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Pharmingen 51-668981E
96 Well plate for cell culture Costar 3596 Flat bottom
Agitator CRM Globe CRM-OS1 
Antibody LL37   Santa Cruz Biotechnology  sc-166770
Blood collection tubes BD VACUTAINER 368171 K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)  Sigma-Aldrich  21878
Centrifuge Hettich 1406-01
Coverslip Madesa M03-CUB-22X22 22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) Caisson 1201022
Falcon tubes 50 mL CORNING  430829
Flow Cytometry Tubes Miltenyi Biotec  5 mL – Without caps
FlowJo Software BD Biosciences Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope DM 2000  LEICA 
Fluoroshield with DAPI  Sigma-Aldrich  F6057 
Incubator  NUAIRE UN-4750
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec  Flow cytometer
Microplate reader photometer  Clarkson Laboratory – CL 
Microtubes 1.5 mL Zhejiang Runlab Tech 35200N wire snap 
Minitab Software Minitab Statistical analysis
Needles BD VACUTAINER 301746 Diameter 1.34 mm
Optical microscope VELAB VE-B50
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x) Caisson PBL07-500ML
Pyrex culture tubes CORNING  CLS982025 N°9820
RPMI 1640 1x Corning  10-104-CV contains Glutagro
Slides Madesa PDI257550 22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4% SIGMA T8154-100ML

References

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Almaraz-Arreortua, A., Sosa-Luis, S. A., Ríos-Ríos, W. d. J., Romero-Tlalolini, M. d. l. Á., Aguilar-Ruiz, S. R., Baltiérrez-Hoyos, R., Torres Aguilar, H. Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli. J. Vis. Exp. (189), e64522, doi:10.3791/64522 (2022).

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