エクスビボ 尿路上皮細胞における機械的に活性化されたCa2+ トランジェントの解析
Summary
このプロトコルは、蛍光Ca2+ センサーGCaMP5Gを使用して、天然尿路上皮細胞における機械的に活性化されたイオンチャネルの機能を評価する方法論を説明しています。
Abstract
機械的に活性化されたイオンチャネルは、伸張力やせん断力などの機械的刺激を電気的および生化学的信号に変換する生物学的トランスデューサです。哺乳類では、機械的に活性化されたチャネルは、触覚、聴覚、赤血球体積調節、基礎血圧調節、および膀胱充満感の感覚などの多様なプロセスにおける外部および内部刺激の検出に不可欠です。機械的に活性化されたイオンチャネルの機能は、パッチクランプ法を用いてin vitro設定で広く研究されてきましたが、多くの場合、これらのチャネルの発現部位(例えば、求心性末端、メルケル細胞、圧受容器、および尿細管)へのアクセスが制限されているため、またはパッチクランプ技術を適用することが困難であるため(例えば、 尿路上皮傘細胞の頂端表面)。このプロトコルは、ex vivo尿路上皮調製物における蛍光センサーGCaMP5Gを使用して機械的に誘発されたCa2+過渡現象を評価する手順を説明しており、他の天然組織調製物における機械的に誘発されたCa2+事象の研究に容易に適合できる技術である。
Introduction
尿路の上皮細胞は、尿路がネフロンを通って移動し、尿が腎盂から汲み出され、尿管を通って膀胱に貯蔵されるときに機械的な力を受けます。尿路を覆う上皮細胞に流体が及ぼす機械的力(せん断応力や伸張など)が、近位尿細管のタンパク質と遠位ネフロンの溶質の再吸収を調節することが長い間認識されてきました1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、12,13、ならびに膀胱および排尿における尿の貯蔵14,15,16,17。
機械的刺激の電気的および生化学的シグナルへの変換は、メカノトランスダクションと呼ばれるプロセスであり、細胞構造の変形または関連する細胞外マトリックスに応答するタンパク質によって媒介される18、19、20、21。機械的に活性化されたイオンチャネルは、膜の張力、圧力、またはせん断応力の変化に応答して、閉じた状態から開いた透過性状態に遷移するという意味で独特です18、19、20、21、22。さらに、Ca2+トランジェントは、インテグリン媒介メカノトランスダクションによって、または細胞−細胞接合部23、24、25、26におけるメカノ応答性接着系の活性化によって開始され得る。イオンチャネル機能は、通常、細胞膜とパッチピペット27との間にギガオームシールを形成することを含むパッチクランプ技術を用いて評価される。しかしながら、緻密な細胞外マトリックスを有する深部組織層に位置する細胞(例えば、腎臓尿細管)または物理的障壁(例えば、グリコカリックス)によって囲まれている細胞は、ガラスマイクロピペットではアクセスが困難である。同様に、埋め込まれた細胞、または機械的安定性の悪い組織(尿路上皮など)の不可欠な部分である細胞は、パッチクランプ技術では容易に研究できません。機械的に活性化されたイオンチャネルの多くはCa2+を透過するため、別のアプローチは、Ca2+感受性色素またはGCaMPなどの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬(GECI)を使用した蛍光顕微鏡法によってそれらの活性を評価することです。タンパク質工学における最近の取り組みにより、GECI 28,29,30のダイナミックレンジ、感度、および応答が大幅に向上し、遺伝学の進歩により、特定の細胞集団での発現が可能になり、メカノトランスダクションの研究に理想的になりました。
尿路上皮、膀胱の内部を覆う層状上皮は、バリアとして機能し、膀胱間質への尿中溶質の拡散を防ぎますが、トランスデューサーとしても機能し、膀胱の充満感を感知し、これらのイベントを基礎となる神経と筋肉組織に伝達します16。以前の研究では、尿路上皮とその下にある組織との間の通信には、機械的に活性化されたイオンチャネルPiezo1およびPiezo2が必要であることが示されています31。尿路上皮細胞において機械的に誘導されたCa2+一過性を評価するために、アデノウイルス遺伝子導入を使用して尿路上皮細胞においてCa2+センサーGCaMP5Gを発現させるという記載の新しい技術が開発された。この技術は、最も外側の傘細胞層に簡単にアクセスできる粘膜シート調製と、閉じたガラスマイクロピペットによる個々の細胞の機械的刺激と時間の経過に伴う蛍光の変化の記録を同時に行うコンピューター支援システムを採用しています。
Protocol
動物の世話と取り扱いは、ピッツバーグ大学施設動物管理および使用委員会に従って実施されました。本研究では、生後2〜4か月のC57Bl / 6Jマウスの雌を使用しました。マウスは商業的に入手した( 材料表参照)。 1.機器の組み立てとセットアップ 高解像度カメラと安定した光源を備えた正立顕微鏡でCa 2+ イメージングを実行します(…
Representative Results
本プロトコルは、蛍光Ca2+センサーGCaMP5Gを用いてアンブレラ細胞における機械的に誘発されたCa2+過渡現象を評価する技術を記載する。アデノウイルス形質導入は、その高い効率と高レベルの発現を生じるため、尿路上皮細胞でGCaMP5Gを発現するために採用されました。形質導入された膀胱からの染色された凍結切片の蛍光画像を図2Dに示す。これらの実験…
Discussion
すべての生物、そして一見ほとんどの細胞型は、機械的刺激に応答するイオンチャネルを発現する20、33、34、35、36、37。これらの機械的に活性化されたチャネルの機能は、主にパッチクランプ技術で評価されています。しかし、アクセシビリテ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)およびS10OD028596(G.A.へ)、およびピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によって支援されました。
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
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Cite This Article
Carattino, M. D., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (187), e64532, doi:10.3791/64532 (2022).