Valutazione delle presunte proprietà anticriptococco degli estratti grezzi e chiarificati dai molluschi
Summary
Il patogeno fungino umano Cryptococcus neoformans produce una varietà di fattori di virulenza (ad esempio, peptidasi) per promuovere la sua sopravvivenza all’interno dell’ospite. Le nicchie ambientali rappresentano una fonte promettente di nuovi inibitori naturali della peptidasi. Questo protocollo delinea la preparazione di estratti di molluschi e la valutazione del loro effetto sulla produzione di fattori di virulenza fungini.
Abstract
Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano incapsulato con una distribuzione globale che infetta principalmente individui immunocompromessi. L’uso diffuso di antifungini in ambito clinico, il loro uso in agricoltura e l’ibridazione del ceppo hanno portato ad una maggiore evoluzione della resistenza. Questo crescente tasso di resistenza contro gli antimicotici è una preoccupazione crescente tra i medici e gli scienziati di tutto il mondo, e vi è una maggiore urgenza di sviluppare nuove terapie antifungine. Ad esempio, C. neoformans produce diversi fattori di virulenza, inclusi enzimi intra ed extracellulari (ad esempio, peptidasi) con ruoli nella degradazione dei tessuti, nella regolazione cellulare e nell’acquisizione di nutrienti. L’interruzione di tale attività della peptidasi da parte degli inibitori perturba la crescita e la proliferazione dei funghi, suggerendo che questa potrebbe essere una strategia importante per combattere l’agente patogeno. È importante sottolineare che gli invertebrati come i molluschi producono inibitori della peptidasi con applicazioni biomediche e attività antimicrobica, ma sono poco esplorati in termini di utilizzo contro i patogeni fungini. In questo protocollo, è stata eseguita un’estrazione globale dai molluschi per isolare potenziali inibitori della peptidasi in estratti grezzi e chiarificati e sono stati valutati i loro effetti contro i classici fattori di virulenza criptococcica. Questo metodo supporta la prioritizzazione dei molluschi con proprietà antifungine e offre opportunità per la scoperta di agenti anti-virulenza sfruttando gli inibitori naturali presenti nei molluschi.
Introduction
Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano che produce una malattia grave negli ospiti immunocompromessi, come gli individui che vivono con l’HIV / AIDS1, e porta a circa il 19% dei decessi correlati all’AIDS2. Il fungo è suscettibile a diverse classi di antimicotici, tra cui azoli, polieni e flucitosina, che esercitano attività fungicida e fungistatica utilizzando meccanismi distinti 3,4. Tuttavia, l’uso estensivo di antifungini in ambito clinico e agricolo combinato con l’ibridazione del ceppo ha amplificato l’evoluzione della resistenza in più specie fungine, tra cui C. neoformans5.
Per superare le sfide della resistenza antifungina e ridurre la prevalenza delle infezioni fungine su scala globale, un approccio promettente è quello di utilizzare i fattori di virulenza di Cryptococcus spp. (ad esempio, adattabilità alla temperatura, capsula di polisaccaridi, melanina ed enzimi extracellulari) come potenziali bersagli terapeutici 4,6 . Questo approccio ha diversi vantaggi, in quanto questi fattori di virulenza sono ben caratterizzati in letteratura e il targeting di questi fattori potrebbe potenzialmente ridurre i tassi di resistenza antifungina imponendo una pressione selettiva più debole attraverso la compromissione della virulenza piuttosto che mirare alla crescita cellulare6. In questo contesto, numerosi studi hanno valutato la possibilità di colpire enzimi extracellulari (ad esempio, proteasi, peptidasi) per ridurre o inibire la virulenza di Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismi come invertebrati e piante non possiedono un sistema immunitario adattativo per proteggersi dagli agenti patogeni. Tuttavia, si basano su un forte sistema immunitario innato con una vasta gamma di composti chimici per affrontare microrganismi e predatori10. Queste molecole includono gli inibitori della peptidasi, che svolgono ruoli importanti in molti sistemi biologici, compresi i processi cellulari dell’immunità degli invertebrati, come la coagulazione dell’emolinfa, la sintesi di citochine e peptidi antimicrobici e la protezione degli ospiti inattivando direttamente le proteasi dei patogeni11. Pertanto, gli inibitori della peptidasi da invertebrati come i molluschi possiedono potenziali applicazioni biomediche, ma molti rimangono non caratterizzati10,12,13. In questo contesto, ci sono circa 34 specie di molluschi terrestri in Ontario e 180 molluschi d’acqua dolce in Canada14. Tuttavia, la loro profilazione approfondita e la caratterizzazione sono ancora limitate15. Questi organismi rappresentano un’opportunità per l’identificazione di nuovi composti con potenziale attività antifungina10.
In questo protocollo, vengono descritti metodi per isolare e chiarire estratti da invertebrati (ad esempio, molluschi) (Figura 1) seguiti dalla misurazione della presunta attività inibitoria della peptidasi. Le proprietà antifungine di questi estratti vengono quindi valutate misurando il loro impatto sulla produzione del fattore di virulenza di C. neoformans utilizzando saggi fenotipici (Figura 2). È importante notare che le differenze nelle proprietà antifungine tra estratti grezzi e chiarificati possono essere indicative di fattori microbici (ad esempio, metaboliti secondari o tossine prodotte dal microbioma ospite) del mollusco, che possono influenzare le osservazioni sperimentali. Tali risultati supportano la necessità che questo protocollo valuti sia gli estratti grezzi che quelli chiarificati in modo indipendente per svelare le modalità di azione. Inoltre, il processo di estrazione è imparziale e può consentire il rilevamento di proprietà antimicrobiche contro una pletora di agenti patogeni fungini e batterici. Pertanto, questo protocollo fornisce un punto di partenza per la prioritizzazione delle specie di molluschi con proprietà antifungine contro C. neoformans e l’opportunità di valutare le connessioni tra attività enzimatica e produzione di fattori di virulenza attraverso meccanismi inibitori putativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di estrazione qui descritto delinea l’isolamento di composti da molluschi raccolti dall’Ontario, in Canada, e dimostra una nuova indagine sull’uso di estratti di molluschi contro il patogeno fungino umano, C. neoformans. Questo protocollo si aggiunge a un crescente corpo di ricerca che studia l’attività degli inibitori della peptidasi dagli invertebrati13. Durante l’estrazione, alcuni campioni di estratto erano difficili da filtrare-sterilizzare, probabilmente a causa della…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri del Geddes-McAlister Lab per il loro prezioso supporto durante questa indagine e il loro feedback manoscritto. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dell’Ontario Graduate Scholarship e dell’International Graduate Research Award – University of Guelph a D. G.-G e della Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) e dell’Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award per J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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