הפרוטוקול המוגש כאן מסביר את צנרת הסיליקו המלאה הדרושה לחיזוי ולאפיון פונקציונלי של CirRNAs מנתוני שעתוק ריצוף RNA החוקרים אינטראקציות מארח-פתוגן.
רנ”א מעגלי (circRNAs) הוא סוג של רנ”א לא מקודד שנוצר באמצעות שחבור אחורי. מעגלי רנ”א אלה נחקרים בעיקר בשל תפקידם כרגולטורים של תהליכים ביולוגיים שונים. יש לציין כי ראיות חדשות מוכיחות כי CirRNA מארח יכול לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בעת הדבקה בפתוגנים (למשל, שפעת ווירוסי קורונה), דבר המצביע על תפקיד של circRNA בוויסות תגובות החיסון המולד של המארח. עם זאת, חקירות על תפקידם של circRNAs במהלך זיהומים פתוגניים מוגבלות על ידי הידע והמיומנויות הדרושים לביצוע הניתוח הביואינפורמטי הדרוש לזיהוי DE circRNAs מנתוני ריצוף RNA (RNA-seq). חיזוי וזיהוי ביואינפורמטיקה של circRNA הוא חיוני לפני כל אימות, ומחקרים פונקציונליים המשתמשים בטכניקות מעבדה רטובות יקרות וגוזלות זמן. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול שלב אחר שלב של חיזוי סיליקו ואפיון של circRNAs באמצעות נתוני RNA-seq מסופק בכתב יד זה. ניתן לחלק את הפרוטוקול לארבעה שלבים: 1) חיזוי וכימות של DE circRNA באמצעות צינור CIRIquant; 2) ביאור באמצעות circBase ואפיון של DE circRNAs; 3) חיזוי אינטראקציה CircRNA-miRNA דרך צינור Circr; 4) ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים הוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG). צינור זה יהיה שימושי בהנעת מחקר עתידי במבחנה ו-in vivo כדי לפענח עוד יותר את התפקיד של circRNA באינטראקציות מארח-פתוגן.
אינטראקציות מארח-פתוגן מייצגות יחסי גומלין מורכבים בין הפתוגנים לבין אורגניזמים מארחים, אשר מעוררים את התגובה החיסונית המולדת של המארחים שבסופו של דבר מביאה לסילוק פתוגנים פולשים 1,2. במהלך זיהומים פתוגניים, מספר רב של גנים חיסוניים המאכסן מווסתים כדי לעכב את השכפול והשחרור של פתוגנים. לדוגמה, גנים נפוצים המעוררים אינטרפרון (ISGs) המווסתים על זיהומים פתוגניים כוללים ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ו- OASL 3,4. מלבד גנים מקודדי חלבונים, מחקרים דיווחו גם כי RNA שאינו מקודד כגון RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), microRNA (miRNAs) ו- RNA מעגלי (circRNAs) גם לשחק תפקיד והם מווסתים בו זמנית במהלך זיהומים פתוגניים 5,6,7. בניגוד לגנים מקודדי חלבונים המקודדים בעיקר חלבונים כמולקולות פונקציונליות, RNA לא מקודד (ncRNAs) ידוע כמתפקד כמווסת של גנים ברמת השעתוק ואחרי השעתוק. עם זאת, מחקרים הכוללים השתתפות של RNA לא מקודד, במיוחד circRNAs, בוויסות הגנים החיסוניים של המארחים אינם מדווחים היטב בהשוואה לגנים מקודדי החלבון.
CircRNAs מאופיינים באופן נרחב על ידי מבנה לולאה רציפה סגורה קוולנטית, אשר נוצר באמצעות תהליך שחבור לא קנוני שנקרא שחבור אחורי8. תהליך השחבור האחורי, בניגוד לתהליך השחבור של רנ”א ליניארי קוגנטי, כולל קשירה של אתר התורם במורד הזרם לאתר המקבל במעלה הזרם, ויוצר מבנה בצורת מעגל. נכון לעכשיו, הוצעו שלושה מנגנוני שחבור אחוריים שונים עבור הביוגנזה של circRNAs. אלה הם RNA binding protein (RBP) mediated circularization9,10, intron-pairing-driven circularization 11, and lariat-driven circularization12,13,14. בהתחשב בכך ש-circRNA מחוברים מקצה לקצה במבנה מעגלי, הם נוטים להיות עמידים באופן טבעי לעיכול אקסונוקלאז רגיל, ולכן נחשבים יציבים יותר מעמיתיהם הליניאריים15. מאפיין נפוץ נוסף המוצג על ידי circRNA כולל ביטוי ספציפי לסוג התא או הרקמה במארחים16.
כפי שמשתמע מהמבנה הייחודי שלהם ומהביטוי הספציפי שלהם לתא או לרקמה, התגלו כבעלי תפקידים ביולוגיים חשובים בתאים. נכון להיום, אחד התפקידים הבולטים של סירק-רנ”א הוא תפקידם כספוגי מיקרו-רנ”א (miRNA)17,18. תפקיד רגולטורי זה של circRNAs מתרחש באמצעות קשירה משלימה של נוקלאוטידים circRNA עם אזור הזרעים של miRNAs. אינטראקציה כזו של circRNA-miRNA מעכבת את תפקודי הבקרה הרגילים של miRNA על mRNA מטרה, ובכך מווסתת את ביטוי הגנים19,20. בנוסף, CirRNAs ידועים גם לווסת ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם חלבונים קושרי RNA (RBPs) ויצירת קומפלקסים RNA-חלבון21. למרות ש-circRNA מסווגים כ-RNA שאינו מקודד, יש גם ראיות לכך ש-circRNA יכול לשמש כתבניות לתרגום חלבונים22,23,24.
לאחרונה הודגם כי CirRNAs ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות יחסי הגומלין בין המאכסן לפתוגן, במיוחד בין המארחים לנגיפים. באופן כללי, מניחים כי הרנ”א של הפונדקאי מסייע בוויסות התגובה החיסונית של הפונדקאי כדי לחסל את הפתוגנים הפולשים. דוגמה ל-circRNA שמקדם תגובות חיסוניות של המארח היא circRNA_0082633, שדווחה על ידי Guo et al.25. CirRNA זה משפר את איתות אינטרפרון מסוג I (IFN) בתוך תאי A549, אשר מסייע לדכא שכפול וירוס שפעת25. יתר על כן, Qu et al. דיווחו גם על CirRNA אינטרוני אנושי, הנקרא circRNA AIVR, המקדם חסינות על ידי ויסות הביטוי של חלבון קושר CREB (CREBBP), מתמר אותות של IFN-β26,27. עם זאת, קיימים גם סירק-רנ”א הידועים כמקדמים את הפתוגנזה של מחלה בעת זיהום. לדוגמה, Yu et al. דיווחו לאחרונה על התפקיד שממלא CirRNA שחבור מתחום אצבע אבץ GATA המכיל את הגן 2A (circGATAD2A) בקידום שכפול נגיף H1N1 באמצעות עיכוב של אוטופגיה של התא המארח28.
כדי לחקור ביעילות circRNAs, מיושם בדרך כלל אלגוריתם חיזוי circRNA כלל-גנומי, ואחריו אפיון בסיליקו של המועמדים החזויים ל-circRNA לפני שניתן לבצע מחקרים פונקציונליים כלשהם. גישה ביואינפורמטית כזו לחיזוי ואפיון CirRNA היא פחות יקרה ויותר חסכונית בזמן. זה עוזר לחדד את מספר המועמדים להיחקר באופן פונקציונלי ועשוי להוביל לממצאים חדשים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט מבוסס ביואינפורמטיקה לזיהוי, אפיון וביאור פונקציונלי של circRNA במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן. הפרוטוקול כולל זיהוי וכימות של circRNA ממערכי נתונים של ריצוף RNA, ביאור באמצעות circBase, ואפיון המועמדים ל-circRNA במונחים של סוגי circRNA, מספר גנים חופפים ואינטראקציות circRNA-miRNA חזויות. מחקר זה מספק גם את הביאור הפונקציונלי של הגנים ההוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוח העשרה.
כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, RNA-seq מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A שימש כדוגמה. נבדקו סירקרנ”א המתפקדים כספוגי miRNA פוטנציאליים באינטראקציות פונדקאי-פתוגן והעשרה תפקודית של GO ו-KEGG בתוך פונדקאי. למרות שיש מגוון רחב של כלי circRNA זמין באינטרנט, כל אחד מהם הוא חבילה עצמאית שאינה אי?…
The authors have nothing to disclose.
המחבר רוצה להודות לטאן קה אן ולד”ר קמרון בראקן על ביקורתם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית מענקי מחקר בסיסית (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ומענק מחקר בעל השפעה גבוהה באוניברסיטת מלאיה (UM. ג/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).
Bedtools | GitHub | https://github.com/arq5x/bedtools2/ | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr. |
BWA | Burrows-Wheeler Aligner | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome |
Circr | GitHub | https://github.com/bicciatolab/Circr | Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites |
CIRIquant | GitHub | https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant | Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs |
Clusterprofiler | GitHub | https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler | Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment |
CPU | Intel | Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) | Specifications used to run this entire protocol. |
Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/download.html | Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network |
FastQC | Babraham Bioinformatics | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files |
HISAT2 | http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome | |
Linux | Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) | https://releases.ubuntu.com/focal/ | Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol. |
miRanda | http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr | |
Pybedtools | pybedtools 0.8.2 | https://pypi.org/project/pybedtools/ | Needed for BED file genomic manipulation |
Python | Python 2.7 and 3.6 or abover | https://www.python.org/downloads/ | To run necessary library modules |
R | The Comprehensive R Archive Network | https://cran.r-project.org/ | To manipulate dataframes |
RNAhybrid | BiBiServ | https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |
RStudio | RStudio | https://www.rstudio.com/ | A workspace to run R |
samtools | SAMtools | http://www.htslib.org/ | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
StringTie | Johns Hopkins University: Center for Computational Biology | http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
TargetScan | GitHub | https://github.com/nsoranzo/targetscan | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |