본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.
인간 만능 줄기 세포에서 자연 살해 (NK) 세포의 분화는 면역 요법을위한 임상 등급 세포 제품에 대한 연구 및 제조를 가능하게합니다. 여기에서는 무혈청 상용 배지와 사이토카인(인터루킨[IL]-3, IL-7, IL-15, 줄기세포 인자[SCF] 및 FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드[Ftl3L])의 칵테일을 사용하여 인간 확장 전위 줄기세포(hEPSC)를 3차원(3D) 및 2차원(2D) 배양 기술을 통해 시험관 내에서 NK 세포 특성을 가진 세포로 분화시키는 2상 프로토콜입니다. 이 프로토콜에 따라 CD3-CD56+ 또는 CD45+CD56+ NK 세포가 지속적으로 생성됩니다. 종양 표적과 3 시간 동안 공동 배양 할 때, 분화 된 생성물은 IL-2 비 의존적 영구 세포주 인 NK92mi 세포와 비교하여 경미한 세포 독성을 나타낸다. 이 프로토콜은 3D 구조의 생성을 통해 분화 미세 환경의 복잡성을 보존하여 면역 세포와 틈새 사이의 공간적 관계에 대한 연구를 용이하게합니다. 한편, 2D 배양 시스템은 섬세한 분화 틈새를 손상시키지 않으면서 세포 분화의 일상적인 표현형 검증을 가능하게 합니다.
인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)와 같은 기존의 만능 줄기 세포와 비교할 때, 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)는 배아 외 및 배아 계통으로 분화 할 수 있기 때문에 전능성 상태에 더 가깝습니다1. 예를 들어, hEPSC는 영양막세포 1 및 난황낭 유사 세포2로 분화 될 수 있습니다. hEPSC의 고유 한 효능을 달성하기 위해 개별 분열구는 EPSC 배지 (EPSCM)라고하는 계통 약속 신호 전달1을 억제하는 여러 개의 소분자를 포함하는 배지에서 배양됩니다. EPSCM에서 hESC 및 hiPSC를 배양하면 이전에 제한된 효능을 확장하여 영양막 세포로 분화합니다1.
만능 줄기 세포는 새로운 유전자 변형을 실험하기위한 귀중한 연구 도구입니다. 만능 줄기 세포의 자가 재생 및 분화 능력으로 인해 만능 줄기 세포의 형질전환된 클론 하나는 동일한 유전자좌에서 동일한 유전자 변형을 갖는 분화된 세포 산물을 생산할 수 있습니다. Zhu와 Kaufman은 기존의 만능 줄기 세포 (hESC 및 hiPSC)에서 NK 세포 분화를위한 표준을 수립했습니다 3. 첫째, 그들은 만능 줄기 세포에서 유래 한 배아체에서 조혈 줄기 세포 (HSC)를 유도했습니다. 줄기 세포 인자 (SCF), FMS 유사 티로신 키나아제 3 리간드 (Ftl3L), 인터루킨 (IL) -7, IL-15 및 IL-3의 초기 보충제를 추가하면 HSC가 자연 살해 (NK) 세포로 발전했습니다. 그 후, 그들은 IL-2의 지속적인 보충으로 막 결합 IL-21을 나타내는 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)로 NK 세포를 확장했습니다. 연구자들은 키메라 항원 수용체(CAR-iNK)가 부여된 iPSC 유래 자연 살해 세포를 생성하기 위해 이 접근법을 면역 요법에 적용했습니다.4.
인간 NK 세포는 말초 혈액에서 CD3-CD56+ 백혈구로 정의됩니다. 그들은 바이러스에 감염된 세포와 종양 세포에 대한 효과제입니다5. NK 세포의 일부 억제 수용체는 정상 세포에서 유비쿼터스로 발현되는 분자를 인식합니다. 예를 들어, NK 세포 상에서 발현된 NKG2A/CD94 이종이량체는 MHC 클래스 I 분자5를 인식한다. 한편, NK 세포의 활성화 수용체는 NKG2D가 형질전환 유도 MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA/MICB)6를 인식하는 것과 같이 스트레스 유발 리간드를 인식합니다. 일부 형질전환 세포는 면역 감시를 피하기 위해 “자가 리간드”를 하향조절하고 비정상적인 리간드를 상향 조절하여 NK 세포가 용균 기계를 실행하도록 합니다. NK 세포의 내재적 항 종양 능력은이 면역 세포 유형에 주목을 불러 일으켰습니다.
배아 및 배아 외 혈통을 동시에 발생시키는 능력은 hEPSC를 기존의 다 능성 줄기 세포보다 배아 발달 틈새의 더 충실한 요약으로 만들 수 있습니다. 경험상 hiPSC보다 hEPSC의 효능을 유지하는 것이 더 쉽습니다. 본 연구에서는 hEPSC를 편향시켜 조혈 계통으로 발전하고 나중에 전구 세포를 시험관 내에서 자연 살해 (NK) 세포로 분화시키는 프로토콜이 개발되었습니다 (그림 1). 프로토콜에서는 혈청 불일치를 피하기 위해 상업용 매체를 사용하고 사이토카인을 단계적으로 추가하여 림프 계통으로 편향 분화합니다. 이 프로토콜에는 인간 NK 세포와 표현형 및 기능적으로 유사한 CD3-CD56+/CD45+CD56+ 세포를 유도하면서 복잡한 3D 미세 환경을 보존하는 두 가지 시스템이 있습니다.
이 프로토콜은 면역 세포와 분화 틈새의 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있으며 면역 치료 용도로 세포 제품을 정제할 가능성이 있을 수 있습니다.
hEPSC에서 CD45+CD56+ 세포의 성공적인 분화를 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 사전 분화 (단계 1.2)는 EPSC 배지가 계통 약속1의 억제제를 포함하기 때문에 중요합니다. 사전 분화 후, hEPSC의 돔 모양의 콜로니는 평평 해집니다 (그림 2B). hEPSC로부터 EB를 형성하는 동안 Rho- 키나제 억제제 (ROCKi) 인 Y27632 (단계 1.3)의 첨가는 해리 후 hEPSC의 생존에 필수적입니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 각 트랜스웰에 심어진 EB의 수입니다. 소규모 시스템이기 때문에 트랜스웰당 2-3개의 EB가 미디어의 과소비를 방지하는 최적의 밀도입니다. 공기-액체 계면은 3D 시스템에 대한 NK 세포 분화의 전체 과정 동안 유지되며, 이는 기질 세포의 극성을 유지하고 AGM 유래 조혈 전구체14,15의 확장을 지원하는 것으로 여겨집니다.
앞서 언급했듯이 트랜스웰의 EB 밀도는 성공적인 차별화를 위한 결정 요소입니다. 이것의 핵심 신호는 트랜스 웰에 EB를 이식 한 지 1 일 후에 배지의 색입니다. 색상이 빠르게 노란색으로 변하면 오염 또는 과밀을 나타냅니다. 이 문제를 해결하려면 1mL 피펫을 사용하여 추가 EB를 수동으로 픽업하여 다른 트랜스웰로 옮겨야 합니다.
이 프로토콜의 주요 한계는 IVD 제품에서 CD3-/CD45+ CD56+ 세포의 순도이며, 이는 순수한 NK92mi 세포에 비해 열등한 세포독성에 부분적으로 책임이 있는 것으로 여겨집니다. 3D 배양 시스템은 3개의 배아 배아 층과 유사한 EB의 생성을 통해 조혈 전구 세포를 유도하는 데 사용되었습니다. 이 전략은 골수 미세 환경에서 혈액 세포의 발달을 모방하여 분화를 지원하기 위해 기질 세포의 필요성을 제거합니다3. 조혈 전구 세포를 정제하기 위한 분류 단계가 없으면 IVD 제품의 순도가 감소할 것으로 예상됩니다. 종말점 제품의 순도를 높이면서 복잡한 차별화 틈새 시장을 유지하는 전략은 분류된 CD3-CD56+ IVD 제품에 대한 확장 방법을 개발하는 것입니다. 예를 들어, 분류된 CD3-CD56+ IVD 제품은 막 결합 IL-21로 조작된 방사선 조사된 K562 세포와 같은 인공 항원 제시 세포(aAPC)에서 배양할 수 있습니다. 배양 물에서 IL-2를 공급하면이 방법은 NK 세포 수3을 1,000 배 증가시킬 수 있습니다.
또 다른 한계는 양성 참조로서 선의의 인간 NK 세포에 대한 제한된 접근이다. NK92mi는 공동 배양 분석에 사용되는 긍정적 인 기준이지만 충분히 정확하지는 않습니다. NK92mi 세포는 활성화 된 NK 세포 표현형16을 발현하는 영구 세포주 인 NK92 세포에서 조작되어 배양 요구 사항을 충족하기 위해 IL-2를 자율적으로 생성합니다. NK92 세포는 인간 1차 NK 세포(17)보다 시험관내에서 K562 세포에 대해 우수한 사멸 활성을 나타낸다. 말초 혈액 NK 세포의 세포 독성을 병행하여 IVD 제품의 종양 살상 능력을 보다 공정하게 비교할 수 있지만 불행히도 혈액 은행에 대한 접근이 부족합니다.
이 두 시스템 배양 프로토콜은 hEPSC에서 CD3-/CD45+CD56+ 세포를 생성하는 것을 목표로 합니다. FACS를 사용한 표면 마커 및 세포 독성 평가는 분화 틈새를 방해하지 않고 2D 시스템의 세포에서 일상적으로 수행 할 수 있습니다. CD3-CD56+ 세포의 백분율 차이에도 불구하고, 3D 및 2D 시스템은 CD56 발현에서 유사한 변이를 갖는 CD3-CD56+ 세포를 유도할 수 있으며(그림 3), 2D 시스템은 3D 배양 조건으로부터 림프성 전구세포의 존재를 반영한다.
3D 배양 시스템 활용의 중요성은 공간 전사체학 또는 이미징 질량분석법과 같은 고해상도 프로파일링 분석을 사용하여 복잡한 분화 틈새 내에서 공간적 관계 및 세포-세포 상호 작용을 연구할 수 있다는 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
Handi Cao 박사, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung 및 Celine Chan의 기술 지원과 유용한 토론에 감사드립니다. 이 작업은 플랫폼 기술 기금의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 로 작성되었습니다.
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |