Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging
Summary
In diesem Protokoll wird ein Ansatz zur Erzeugung von Epithelorganoiden aus primärem Normal- und Tumorbrustgewebe durch differentielle Zentrifugation erörtert. Darüber hinaus sind Anleitungen für die dreidimensionale Kultivierung sowie die Immunfluoreszenz-Bildgebung von eingebetteten Organoiden enthalten.
Abstract
Organoide sind aufgrund ihrer selbstorganisierenden Eigenschaften und der Beibehaltung von Funktion und Architektur nach der Vermehrung aus Primärgewebe oder Stammzellen eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Organgewebe. Diese Methode der Organoiderzeugung verzichtet auf die Einzelzelldifferenzierung durch mehrere Passagen und verwendet stattdessen eine differentielle Zentrifugation, um Brustepithel-Organoide aus mechanisch und enzymatisch dissoziierten Geweben zu isolieren. Dieses Protokoll bietet eine optimierte Technik zur schnellen Herstellung kleiner und großer Epithelorganoide aus Maus- und menschlichem Brustgewebe sowie Techniken zur Einbettung von Organoiden in Kollagen und extrazelluläre Basalmatrix. Darüber hinaus werden Anweisungen zur In-Gel-Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung bereitgestellt, um die Morphologie und Dichte der Organoide sichtbar zu machen. Diese Methoden eignen sich für unzählige nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Kokultivierung mit Immunzellen und die Ex-vivo-Metastasenmodellierung mittels Kollageninvasionsassay. Diese Analysen dienen dazu, das Zell-Zell-Verhalten besser aufzuklären und ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung zu schaffen.
Introduction
Die Fähigkeit, Epithelzellen in vitro zu modellieren, war die Grundlage der modernen biomedizinischen Forschung, da sie zelluläre Merkmale erfasst, die in vivo nicht zugänglich sind. Zum Beispiel kann das Züchten von Epithelzelllinien in einer zweidimensionalen Ebene eine Beurteilung der molekularen Veränderungen liefern, die in einer Epithelzelle während der Proliferation auftreten1. Darüber hinaus ist die Messung der dynamischen Regulation zwischen Signalübertragung und Genexpression in In-vivo-Systemen 2 begrenzt. In der Krebsforschung hat die Modellierung von Krebsepithelzelllinien die Identifizierung molekularer Treiber des Krankheitsverlaufs und potenzieller Wirkstoffziele ermöglicht3. Das Züchten von Krebsepithelzelllinien auf einer zweidimensionalen Ebene hat jedoch Grenzen, da die meisten genetisch immortalisiert und modifiziert sind, oft klonaler Natur, aufgrund ihrer Fähigkeit, unter nicht-physiologischen Bedingungen zu wachsen, ausgewählt wurden, in ihrer Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Tumorgewebearchitektur begrenzt sind und Mikroumgebungsinteraktionen in einer realistischen Gewebeumgebung nicht angemessen modellieren4. Diese Einschränkungen zeigen sich besonders deutlich bei der Modellierung der Metastasierung, die in vivo mehrere verschiedene biologische Stadien umfasst, einschließlich Invasion, Verbreitung, Zirkulation und Kolonisierung an der entfernten Organstelle5.
Krebsepithel-Organoide wurden entwickelt, um die 3D-Umgebung und das Verhalten von Tumoren besser zu rekapitulieren 6,7,8. Organoide wurden zunächst aus einzelnen LRG5+ intestinalen Kryptenzellen entwickelt und differenziert, um die 3D-Struktur von Krypten-Zotten-Einheiten darzustellen, die die hierarchische Struktur des Dünndarms in vitro beibehalten 9. Dieser Ansatz ermöglichte die Echtzeit-Visualisierung und Charakterisierung der selbstorganisierenden Gewebearchitektur unter homöostatischen und Stressbedingungen. Als natürliche Erweiterung wurden Krebsepithel-Organoide entwickelt, um viele verschiedene Krebsarten zu modellieren, darunter Darmkrebs10, Bauchspeicheldrüse11, Brust 12, Leber 13, Lunge 14, Gehirn 15 und Magenkrebs 16. Krebsepithel-Organoide wurden genutzt, um die Krebsevolution17,18 und metastasiertes raumzeitliches Verhalten 19,20 zu charakterisieren und die Tumorheterogenität 21 zu untersuchen und Chemotherapienzu testen 22. Krebsepithel-Organoide wurden auch isoliert und während laufender klinischer Studien gesammelt, um das Ansprechen von Patienten auf Krebsmedikamente und Strahlentherapie ex vivo vorherzusagen 8,23,24,25. Darüber hinaus können Systeme, die Krebsepithel-Organoide enthalten, mit anderen Nicht-Krebszellen, wie z. B. Immunzellen, kombiniert werden, um ein umfassenderes Modell der Tumormikroumgebung zu bilden, um Interaktionen in Echtzeit zu visualisieren, aufzudecken, wie Krebsepithelzellen die grundlegende Natur von zytotoxischen Effektor-Immunzellen wie natürlichen Killerzellen verändern, und potenzielle Immuntherapien und antikörper-wirkstoffabhängige zytotoxische Aktivität zu testen26, 27,28. Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Epithelorganoiden ohne Passage und Einbettung in Kollagen und basale extrazelluläre Matrix (ECM). Darüber hinaus werden auch Techniken für die nachgeschaltete Bildgebung von isolierten Organoiden geteilt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Literatur wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung von Tumororganoiden beschrieben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Erzeugung von Tumororganoiden direkt aus dem Tumor ohne Passage vor. Mit dieser Methode sind Tumor-Organoide innerhalb von Stunden nach Beginn des Verfahrens herstellbar und erzeugen nahezu 100 % lebensfähige Organoide, verglichen mit 70 % in der Literatur31. Im Vergleich dazu erfordern andere Methoden eine serielle Passage von Zellen in Organoide über mehrere Woc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Mittel von METAvivor, dem Peter Carlson Trust, der Theresa’s Research Foundation und dem NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543 unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung der University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, einer gemeinsamen Ressource am Simmons Comprehensive Cancer Center, die teilweise vom National Cancer Institute unter der Auszeichnungsnummer P30 CA142543 unterstützt wird. Besonderer Dank geht an alle Mitglieder des Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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