השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם
Summary
פרוטוקול זה מתאר השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון. המודל משחזר מחלה גרורתית מתקדמת של סרטן המעי הגס והחלחולת ומאפשר הערכה של תרופות טיפוליות חדשות בתרחיש רלוונטי קלינית של גרורות ריאה וכבד.
Abstract
במהלך העשור האחרון, מודלים פרה-קליניים יותר של סרטן המעי הגס (CRC) הוקמו באמצעות תאי סרטן שמקורם בחולים וגידולים תלת-ממדיים. מכיוון שאורגנואידים סרטניים שמקורם בחולים יכולים לשמור על המאפיינים של הגידול המקורי, מודלים פרה-קליניים אמינים אלה מאפשרים בדיקת תרופות לסרטן וחקר מנגנוני עמידות לתרופות. עם זאת, מוות הקשור ל- CRC בחולים קשור בעיקר לנוכחות של מחלה גרורתית. לכן חיוני להעריך את יעילותם של טיפולים אנטי-סרטניים במודלים רלוונטיים in vivo שבאמת משחזרים את התכונות המולקולריות העיקריות של גרורות סרטניות בבני אדם. הקמנו מודל אורתוטופי המבוסס על הזרקת תאים סרטניים שמקורם בחולי CRC ישירות לתוך דופן הצקום של עכברים. תאי גידול אלה מפתחים גידולים ראשוניים בצקום ששולחים גרורות לכבד ולריאות, דבר שנצפה לעתים קרובות בחולים עם CRC מתקדם. מודל עכבר CRC זה יכול לשמש להערכת תגובות תרופתיות המנוטרות על ידי טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT), שיטת הדמיה בקנה מידה קטן רלוונטית מבחינה קלינית שיכולה לזהות בקלות גידולים ראשוניים או גרורות בחולים. כאן, אנו מתארים את ההליך הכירורגי ואת המתודולוגיה הנדרשת להשתלת תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון.
Introduction
סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) הוא הגורם השני למוות מסרטן ברחבי העולם1. היכולת ליצור מודלים של גידול in vitro או in vivo הנגזרים מתאי גידול בודדים של מטופל היא בעלת רפואה מדויקת מתקדמת באונקולוגיה. במהלך העשור האחרון, אורגנואידים שמקורם בחולים (PDOs) או xenografts (PDXs) שימשו קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם2. PDOs הם מבנים רב-תאיים במבחנה הדומים לתכונות של רקמת הגידול המקורית ויכולים לארגן את עצמם ולחדש את עצמם3. מודלים מבטיחים אלה במבחנה יכולים לשמש בהצלחה לסינון תרופות ולהקל על מחקר תרגומי. בצד השני, מודלים של PDX משחזרים נאמנה את ה-CRC המקורי בכל הרמות הרלוונטיות, מהיסטולוגיה ועד תכונות מולקולריות ותגובה לתרופות 2,4.
In vivo מודלים של PDX גדלים בעיקר כגידולים תת-עוריים בעכברים מדוכאי חיסון. באמצעות גישה זו, PDX הפכו לתקן הזהב בחקר הסרטן, במיוחד לחקר רגישות או עמידות לתרופות. עם זאת, מקרי מוות הקשורים ל- CRC קשורים בעיקר לנוכחות נגעים גרורתיים בכבד, בריאה או בחלל הצפק, ואף אחת משתי הגישות (PDO או PDX) אינה יכולה לשחזר את ההגדרה הקלינית המתקדמת. בנוסף, האתר הספציפי של צמיחת הגידול הוכח כקובע מאפיינים ביולוגיים חשובים שיש להם השפעה על יעילות התרופה ופרוגנוזה של המחלה2. לכן, יש צורך דחוף להקים מודלים פרה-קליניים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את יעילותן של תרופות אנטי-סרטניות בסביבה גרורתית רלוונטית מבחינה קלינית6.
סורקי טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) יכולים לתפקד כסורקי CT קליניים מוקטנים, ולספק הדמיה ראשונית של גידול וגרורות בעכברים ברזולוציית תמונה בקנה מידה פרופורציונלי לזו של תמונות CT של חולי סרטן7. כדי לנטרל את הניגודיות הירודה של רקמות רכות בטכניקת μCT, ניתן להשתמש בחומרי ניגוד רדיולוגיים עם יוד כדי לשפר את הניגודיות ולהעריך את נטל הגידול. באמצעות גישה של ניגודיות כפולה, יוד פומי ותוך-צפקי ניתן בתזמונים שונים. הניגודיות הניתנת דרך הפה מסייעת להגדיר את הגבולות בין רקמת הגידול לבין תכולת הצקום בתוך המעי. בצד השני, הניגוד הניתן תוך צפקית מאפשר זיהוי הגבולות החיצוניים של מסת הגידול, אשר לעתים קרובות גדל ופולש הצפק8.
כתב היד מתאר פרוטוקול לביצוע השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון, ואת המתודולוגיה לניטור צמיחת גידולי מעיים באמצעות סריקת μCT. כתב היד הנוכחי מראה כי המודל משחזר את התרחיש הקליני של גידולי מעיים מתקדמים ומחלה גרורתית בחולי CRC שלא ניתן לחקור באמצעות מודלים של PDO או PDXO. מכיוון שמודלים אורתוטופיים PDX של CRC משחזרים את התרחיש הקליני של חולי CRC, אנו מסיקים כי הם הטובים ביותר עד כה לבדיקת יעילותן של תרופות אנטי גידוליות בגידולי מעיים מתקדמים ובמחלות גרורתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך העשורים האחרונים, טיפולים אנטי-סרטניים חדשים רבים פותחו ונבדקו בחולים עם סוגי גידולים שונים, כולל סרטן המעי הגס (CRC). למרות שתוצאות מבטיחות במודלים פרה-קליניים נצפו במקרים רבים, היעילות הטיפולית בחולים עם CRC גרורתי מתקדם הייתה מוגבלת לעתים קרובות. לכן, יש צורך דחוף במודלים פרה-קליניים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקרן Cellex, לרשת CIBERONC ולמכון סאלוד קרלוס השלישי על תמיכתם. יתר על כן, אנו מודים גם לפלטפורמת הדימות הפרה-קלינית במכון המחקר Vall d’Hebron (VHIR), שם בוצעו הניסויים.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
