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生物学

Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.

Abstract

Die epigenetische Regulation der Genexpression wird häufig durch histonmodifizierende Enzyme (HMEs) beeinflusst, die heterochromatische oder euchromatische Histonmarkierungen für die transkriptionelle Unterdrückung bzw. Aktivierung erzeugen. HMEs werden durch Transkriptionsfaktoren (TFs) zu ihrem Zielchromatin rekrutiert. Daher ist die Erkennung und Charakterisierung direkter Interaktionen zwischen HMEs und TFs entscheidend, um ihre Funktion und Spezifität besser zu verstehen. Diese Studien wären biologisch relevanter, wenn sie in vivo in lebendem Gewebe durchgeführt würden. Hier wird ein Protokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen in Pflanzenblättern zwischen einer pflanzlichen Histon-Deubiquitinase und einem Pflanzentranskriptionsfaktor mittels Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) beschrieben, das den Nachweis von Komplexen zwischen Proteinmolekülen ermöglicht, die innerhalb von <10 nm voneinander entfernt sind. Zwei Varianten der FRET-Technik werden vorgestellt: SE-FRET (sensibilisierte Emission) und AB-FRET (Akzeptorbleiche), bei der die Energie strahlenfrei vom Donor auf den Akzeptor übertragen oder vom Donor beim Photobleaching des Akzeptors strahlend emittiert wird. Sowohl SE-FRET- als auch AB-FRET-Ansätze können leicht angepasst werden, um andere Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen in planta zu entdecken.

Introduction

Pflanzliche Histon-Deubiquitinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression durch posttranslationale Modifikation von Histonen, insbesondere durch Löschen ihrer Monoubiquitylierungsmarkierungen1. OTLD1 ist bisher eines der wenigen pflanzlichen Histon-Deubiquitinasen, die auf molekularer Ebene in Arabidopsis 2,3 charakterisiert wurden. OTLD1 entfernt Monoubiquitingruppen aus den H2B-Histonmolekülen und fördert dadurch die Entfernung oder Addition von euchromatischer Acetylierung und Methylierungsmodifikationen von H3-Histonen im ZielgenChromatin 4,5. Darüber hinaus interagiert OTLD1 mit einem anderen chromatinmodifizierenden Enzym, der Histon-Lysin-Demethylase KDM1C, um die transkriptionelle Unterdrückung der Zielgene 6,7 zu beeinflussen.

Die meisten Histon-modifizierenden Enzyme haben keine DNA-Bindungsfähigkeiten und können daher ihre Zielgene nicht direkt erkennen. Eine Möglichkeit ist, dass sie mit DNA-bindenden Transkriptionsfaktor-Proteinen zusammenarbeiten, die diese Enzyme binden und zu ihren Chromatinzielen leiten. Insbesondere in Pflanzen ist bekannt, dass mehrere wichtige Histon-modifizierende Enzyme (d. h. Histon-Methyltransferasen 8,9, Histonacetyltransferasen 10, Histon-Demethylasen 11 und Polycomb-Repressionskomplexe12,13,14) durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden. In Übereinstimmung mit dieser Idee wurde kürzlich ein möglicher Mechanismus für die OTLD1-Rekrutierung zu den Zielpromotoren vorgeschlagen, der auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen von OTLD1 mit einem Transkriptionsfaktor LSH1015 basiert.

LSH10 gehört zu einer Familie der pflanzlichen ALOG-Proteine (Arabidopsis LSH1 und Oryza G1), die als zentrale Entwicklungsregulatorenfungieren 16,17,18,19,20,21,22. Die Tatsache, dass die Mitglieder der ALOG-Proteinfamilie DNA-bindende Motive 23 enthalten und die Fähigkeiten zur Transkriptionsregulation22, Kernlokalisation19 und Homodimisierung24 aufweisen, unterstützt die Annahme, dass diese Proteine, einschließlich LSH10, während der epigenetischen Regulation der Transkription als spezifische Transkriptionsfaktoren wirken können. Eine der wichtigsten experimentellen Techniken zur Charakterisierung der LSH10-OTLD1-Wechselwirkung in vivo ist der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)15.

FRET ist ein bildgebendes Verfahren zur direkten Detektion von Nahbereichswechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb von <10 nm voneinanderentfernt von 25 lebenden Zellen. Es gibt zwei Hauptvarianten des FRET-Ansatzes26: sensibilisierte Emission (SE-FRET) (Abbildung 1A) und Akzeptorbleiche (AB-FRET) (Abbildung 1B). In SE-FRET übertragen die interagierenden Proteine – von denen eines mit einem Donorfluorochrom (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) und das andere mit einem Akzeptor Fluorochrom (z. B. monomeres rot fluoreszierendes Protein, mRFP27,28) markiert ist – nicht-strahlend die Energie des angeregten Zustands vom Donor auf den Akzeptor. Da bei dieser Übertragung keine Photonen emittiert werden, entsteht ein fluoreszierendes Signal, das ein Strahlungsemissionsspektrum ähnlich dem des Akzeptors aufweist. In AB-FRET werden Proteininteraktionen basierend auf einer erhöhten Strahlungsemission des Donors detektiert und quantifiziert, wenn der Akzeptor durch Photobleaching dauerhaft inaktiviert wird und daher nicht in der Lage ist, die vom Donor übertragene nicht-strahlende Energie zu empfangen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die subzelluläre Lage der FRET-Fluoreszenz auf die Lokalisation der interagierenden Proteine in der Zelle hinweist.

Die Fähigkeit, FRET in lebenden Geweben einzusetzen und die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine gleichzeitig mit dem Nachweis dieser Interaktion an sich zu bestimmen, macht FRET zur Technik der Wahl für Studien und die erste Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen in vivo. Eine vergleichbare In-vivo-Fluoreszenzbildgebungsmethode, die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC)29,30,31,32, ist ein guter alternativer Ansatz, obwohl BiFC im Gegensatz zu FRET aufgrund der spontanen Assemblierung der autofluoreszierenden BiFC-Reporter 33 falsch positive Ergebnisse erzeugen kann und die Quantifizierung seiner Daten weniger präzise ist.

Dieser Artikel teilt die erfolgreichen Erfahrungen bei der Implementierung von SE-FRET- und AB-FRET-Techniken und stellt ein Protokoll für ihren Einsatz vor, um die Wechselwirkungen zwischen OTLD1 und LSH10 in Pflanzenzellen zu untersuchen.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 verwendet. 1. FRET-Vektorkonstruktion Wählen Sie fluoreszierende Tags für das FRET-Paar Donor/Akzeptor aus.Verwenden Sie EGFP aus pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (siehe Materialtabelle), um den Donorvektor zu erzeugen. Verwenden Sie mRFP aus pPZP-RCS…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die typischen Ergebnisse eines SE-FRET-Experiments, bei dem die Zellkerne gleichzeitig in drei Kanälen (d.h. Donor GFP, Akzeptor mRFP und SE-FRET) aufgezeichnet wurden. Diese Daten wurden verwendet, um Bilder der SE-FRET-Effizienz zu erzeugen, die in einer Pseudo-Farbskala codiert sind. Auf dieser Skala entspricht der Übergang von Blau zu Rot einer Steigerung der FRET-Effizienz, einem Maß für die Protein-Protein-Nähe von 0% bis 100%. In diesem repräsentativen Experime…

Discussion

Dieses FRET-Protokoll ist einfach und leicht zu reproduzieren; Es erfordert auch minimale Versorgungsinvestitionen und verwendet Standardausrüstung für viele moderne Labore. Konkret zeichnen fünf technische Hauptmerkmale die Vielseitigkeit dieses Verfahrens aus. Erstens werden die FRET-Konstrukte mithilfe der ortsspezifischen Rekombination generiert, einem Klonierungsansatz, der einfach zu bedienen ist, genaue Ergebnisse liefert und im Vergleich zum herkömmlichen restriktionsenzymbasierten Klonen Zeit spart. Zweitens…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit im Labor von V.C. wird durch Zuschüsse von NIH (R35GM144059 und R01GM50224), NSF (MCB1913165 und IOS1758046) und BARD (IS-5276-20) an V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
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